Estudio de la acumulación de alfa-sinucleína en neuronas dopaminérgicas embrionarias primarias de ratón

Resumen

Fuente: Er, S. et al., Estudio de la acumulación de α-sinucleína inducida por fibrillas preformadas en neuronas de dopamina del mesencéfalo embrionarias primarias de ratón.J. Vis. Exp. (2020).

Este video demuestra el proceso de cuantificación de la acumulación de alfa-sinucleína en neuronas embrionarias de dopamina de ratón pretratadas con fibrillas preformadas de alfa-sinucleína. Describe los pasos para fijar, teñir y cuantificar las neuronas dopaminérgicas que contienen agregados de alfa-sinucleína mediante inmunofluorescencia.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Preparación

1. Prepare medio neuronal dopaminérgico (DPM) con 0,46% de D-glucosa, 1% de L-glutamina, 1% de N2, 0,2% de primocina, completado con DMEM/F12. Filtre el DPM después de mezclar los ingredientes. Almacene DPM a 4 °C y caliente cada alícuota solo una vez.
   nota: El DPM no debe contener factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), ya que reducirá la acumulación de α-sinucleína en las neuronas dopaminérgicas.
2. Preparar pipetas de vidrio siliconadas que sean extremadamente hidrofóbicas, minimizando así la adherencia a la superficie y la pérdida de células durante la manipulación inicial de las neuronas embrionarias.
   1. Agregue 10 mL de líquido siliconizante a 1 L de agua destilada y mezcle agitando en un recipiente de 2 L. Deje las pipetas de vidrio sumergidas en la solución siliconante durante 15 min.
   2. Enjuague las pipetas de 3 a 5 veces con agua destilada. Seque las pipetas durante la noche a temperatura ambiente (RT) o durante 1-2 h a 100-120 °C en un espacio estéril calentado para acelerar el secado.
   3. Esterilice las pipetas mediante autoclave estándar en una bolsa de autoclave sellada.
3. Prepare placas de 96 pocillos recubiertas de poli-L-ornitina (PO) con fondos transparentes agregando 60 μL de solución de PO en los pocillos centrales de la placa de 96 pocillos que se utilizará para la siembra de las neuronas, dejando al menos una fila/columna de pocillos en los bordes de la placa para evitar efectos de borde. Mantenga la placa recubierta durante la noche a 4 °C o 4 h a RT.
4. Antes de colocar las células, aspire la PO por completo y lave las células tres veces con 100 μL de solución salina tampón de fosfato (PBS) 1x. Aspire 1x PBS de los pocillos y mantenga la tapa de la placa abierta para un secado completo.
   nota: Es posible recoger la orden de compra usada y filtrarla para su reutilización. Esto se puede repetir dos veces para la misma solución de PO.
5. Añadir 50 μL de DPM a los pocillos previamente recubiertos. Aspire DPM de los pocillos con una punta de plástico de 100 μL y rasque simultáneamente el fondo del pocillo con movimientos circulares para eliminar el recubrimiento en el perímetro de cada pocillo. Una isla recubierta de PO permanecerá en el centro del pozo.
6. Bajo una cubierta laminar, agregue 10 μL de DPM en el centro de cada isla recubierta para crear micro islas.
   nota: Una placa con microislas cubiertas de DPM puede mantenerse bajo la campana de flujo laminar durante 1-2 h durante el aislamiento de las células.

>2. Aislamiento del suelo ventral del mesencéfalo de embriones de ratón E13.5

NOTA: Consulte la Figura 1 para conocer los pasos de la disección del piso del mesencéfalo.

1. Antes de la disección, llene una placa de Petri de 10 cm con el tampón de Dulbecco y manténgala en hielo.
2. Eutanasia a una rata hembra preñada E13.5 de acuerdo con las directrices de la institución. Coloque el ratón boca arriba y rocíe la parte anterior del cuerpo con etanol al 70%. Levante la piel por encima del útero con pinzas y haga una incisión con unas tijeras quirúrgicas para exponer el útero.
3. Retire con cuidado el útero y colóquelo en la placa de Petri previamente preparada sobre hielo.
4. Con unas tijeras quirúrgicas debajo de la capucha laminar en RT, extraiga con cuidado los embriones del útero. Retire todos los residuos placentarios de los embriones con pinzas y colóquelos en una nueva placa de Petri de 10 cm llena de tampón de Dulbecco.
5. Con pinzas de disección o agujas, corte el cuarto trasero de la cabeza desde los lugares marcados con flechas negras en la Figura 1A. Retire la pieza cortada del resto del embrión (Figura 1B).
6. Coloque la parte posterior de la pieza cortada hacia el observador (Figura 1C) y ábrala suavemente desde la caudal hasta la craneal (Figura 1D). A partir de 0,5 mm por debajo de la abertura craneal, corte una región de^{2 mm 2} a 3 mm², como se muestra en la Figura 1E.
7. Recoja el piso ventral del mesencéfalo (véase la figura 1F) en un tubo de microcentrífuga vacío de 1,5 mL. Mantenga el tubo de microcentrífuga en hielo hasta que todos los pisos del mesencéfalo se recojan en él.
   nota: Alternativamente, los pisos del mesencéfalo se pueden recolectar con una micropipeta de 1 ml después de la disección de todos los cerebros embrionarios.

3. Establecimiento de cultivos embrionarios primarios del mesencéfalo a partir de embriones de ratón E13.5 en formato de placa de 96 pocillos

1. Después de la recolección de los pisos del mesencéfalo de todos los embriones en el mismo tubo de 1,5 mL, retire el tampón residual de Dulbecco y lave las piezas de tejido tres veces con 500 μL de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin Ca²⁺, Mg²⁺.
2. Retire el HBSS y añada 500 μL de tripsina al 0,5% al tubo. Incubar a 37 °C durante 30 min.
3. Durante la incubación, calentar 1,5 mL de suero fetal bovino (FBS) a 37 °C, añadir 30 μL de DNasa I al FBS y mezclar. Además, pula al fuego la punta de una pipeta de vidrio siliconado. Asegúrese de que el orificio no tenga bordes afilados y que tenga aproximadamente el mismo tamaño que la punta de una micropipeta de 1 ml.
   NOTA: Como alternativa, se puede utilizar una punta de micropipeta de 1 mL de baja adherencia para la trituración. Sin embargo, las pipetas de vidrio siliconadas parecen dar los mejores resultados.
4. Tan pronto como finalice la incubación en el paso 3.2, agregue 500 μL de la mezcla FBS/DNasa al tejido parcialmente digerido. Utilice la pipeta de vidrio para triturar el tejido en la mezcla de FBS/tripsina. Triturar hasta que los tejidos se disocien en partículas diminutas y apenas visibles. Evite las burbujas durante la trituración.
5. Deje que las partículas sobrantes precipiten en el fondo del tubo de microcentrífuga por gravedad. Sin pipetear el precipitado en la parte inferior, recoja el sobrenadante en un tubo cónico de polipropileno vacío de 15 mL.
6. Diluir FBS/DNasa I del paso 3.3 (98:2) con 1.000 μL de HBSS para obtener FBS/DNasa-I/HBSS (49:1:50). Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Añada 1.000 μL de la nueva mezcla a las partículas sobrantes en el tubo de microcentrífuga. Triture de nuevo y repita el paso 3.5.
7. Repita el paso anterior una vez más para utilizar todo FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
8. Una vez que todo el sobrenadante se haya recogido dentro del tubo de 15 mL (de los pasos 3.5, 3.7 y 3.8), use una centrífuga de mesa para centrifugar el sobrenadante (~3 mL) a 100 x g, durante 5 min. Retire el sobrenadante sin tocar las células granuladas en la parte inferior.
9. Lave el pellet de celda agregando 2 mL de DPM al tubo y gírelo hacia abajo a 100 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y repita el lavado 2 veces para minimizar los residuos en las celdas granuladas.
   NOTA: Utilice siempre DPM fresco y calentado para las neuronas cultivadas. Para los pasos de lavado, el DPM no tiene que ser nuevo, sino que debe precalentarse a 37 °C.
10. Diluya las células con DPM fresco y tibio y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga. La cantidad de DPM para la dilución depende del número de embriones utilizados para la disección de tejidos. Por ejemplo, utilice 150 μL de DPM para diluir las células obtenidas de diez embriones.
11. Transfiera 10 μL de células en DPM a un tubo de microcentrífuga. Mézclalos con 10 μL de tinte azul Trypan al 0,4%. Cuente las células vivas (es decir, azul de tripano negativo) utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
    NOTA: Utilice 30,000 celdas para la siembra por pocillo para obtener ~ 1,000 neuronas de dopamina por pocillo. Si la densidad celular es superior a ~ 30,000 celdas por 6 μL, diluya aún más las celdas con DPM antes de colocar el recubrimiento para que el volumen de siembra no sea inferior a 6 μL.
12. Sin tocar el fondo de los pozos, retire el DPM de las microislas creadas en el paso 1.6.
13. Con el fin de obtener una densidad celular reproducible en cada pocillo, mezcle las celdas mediante un pipeteo suave antes de la siembra en el pocillo. Con una micropipeta de 1 a 10 μL, agregue 6 μL de células al centro del pocillo en la ubicación de cada microisla anterior.
14. Llene los pocillos vacíos en los bordes de la placa con 150 μL de agua o 1x PBS para minimizar la evaporación de los pocillos que contienen cultivos neuronales. Incubar la placa en una incubadora a 37 °C, 5% CO₂ durante 1 h.
15. Después de 1 h, retire la placa de la incubadora, agregue 100 μL de DPM en cada pocillo con celdas y vuelva a colocarla en la incubadora.
16. Dos días después de la siembra (día in vitro 2 o DIV2), retire 25 μL y agregue 75 μL de DPM fresco para llevar el volumen final del medio a 150 μL y evitar la evaporación tanto como sea posible.
17. Cambie la mitad del medio con DPM nuevo (es decir, elimine 75 μL y agregue 75 μL de DPM nuevo) en DIV5. No realice ningún cambio de medios después de DIV5.

>4. Inducción de agregados de α-sinucleína en neuronas dopaminérgicas embrionarias primarias por siembra con fibrillas preformadas

Después de cualquier trabajo con fibrillas preformadas de α-sinucleína (PFFs), limpie la cubierta laminar o cualquier equipo que pueda haber entrado en contacto con las PFFs con dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1%, luego con etanol al 70%.

1. Antes del experimento, diluir los PFF con 1x PBS hasta una concentración final de 100 μg/mL. Sonicar los PFF diluidos en tubos de microcentrífuga con un sonicador de baño a alta potencia con enfriamiento en baño de agua a 4 °C durante 10 ciclos, 30 s ON/30 s OFF.
   nota: Es fundamental que las fibrillas se soniquen correctamente para generar fragmentos de ~50 nm de largo. El tamaño de los PFF sonicados puede medirse directamente a partir de imágenes de microscopio electrónico de transmisión de PFFs teñidos. La sonicación puede lograrse como se ha descrito anteriormente en un sonicador de baño de alta potencia. Alternativamente, se puede utilizar un sonicador de punta. Los PFF sonicados pueden almacenarse a -80 °C en pequeñas alícuotas para evitar múltiples ciclos de congelación/descongelación.
2. En DIV8, agregue 3,75 μL de 100 μg/mL de PFF por pocillo a los 150 μL de medio en el pocillo hasta una concentración final de 2,5 μg/mL. Utilice la misma cantidad de 1x PBS para el grupo de control.
3. Prepare paraformaldehído (PFA) al 4% en 1x PBS y almacene las alícuotas a -20 °C. Para ello, siga los pasos que se indican a continuación.
   NOTA: El PFA es tóxico; Use mascarilla y guantes durante la preparación, trabaje siempre bajo una cubierta laminar y deseche todos los residuos sólidos y líquidos de PFA de acuerdo con las instrucciones de la institución.
   1. Caliente 500 mL de 1x PBS en un recipiente de 1 L. Coloque una barra agitadora en el recipiente y coloque el recipiente en un agitador magnético con función de calentamiento. Ajuste la temperatura entre 40 y 60 °C para evitar que hierva mientras mantiene la solución caliente.
   2. Mida 20 g de polvo de PFA debajo del capó en un recipiente medidor de plástico desechable. Agregue con cuidado el polvo de PFA en el recipiente lleno de 1x PBS. Empieza a remover la solución.
   3. Agregue 200 μL de hidróxido de sodio 5 M a la solución y continúe revolviendo durante ~ 15 minutos hasta que el PFA se disuelva por completo.
   4. Después de que la solución parezca homogénea, agregue 168 μL de cloruro de hidrógeno 5 M para equilibrar el pH a ~ 7. Verifique el pH con tiras indicadoras de pH desechables y fijadas por color.
   5. Retire el recipiente del calentador y deje que se enfríe a RT. Filtre la solución y la alícuota para su almacenamiento a -20 °C. Descongele las alícuotas a RT antes de usar y no vuelva a congelar después.
4. En DIV15, extraiga todos los medios de los pocillos mediante pipeteo. Añadir 50 μL de PFA al 4% a cada pocillo para fijar las células e incubar durante 20 min a RT. Después de la incubación, retire el PFA de los pocillos y agregue 100 μL de 1x PBS a cada pocillo para lavar las células. Retire 1 vez PBS y lave 2 veces más.
5. Deje 100 μL de 1x PBS en cada pocillo para evitar que se seque. Guarde la placa a 4 °C hasta que se realice la inmunoquímica.

>5. Tinción inmunofluorescente e imágenes automatizadas de neuronas dopaminérgicas embrionarias primarias en placas de 96 pocillos

1. Eliminar 1x PBS y permeabilizar las células añadiendo 100 μL de Triton X-100 al 0,2% en PBS (PBST) por pocillo e incubando a RT durante 15 min.
2. Retire el PBST y añada 50 μL de suero de caballo normal (NHS) al 5% por pocillo al PBST. Para bloquear la actividad del antígeno inespecífico, incubar en RT durante 1 h.
3. Diluir los anticuerpos primarios contra la tirosina hidroxilasa (TH) y pS129-αsyn (1:2.000) en NHS al 5% en PBST. Añadir 50 μL de anticuerpos diluidos a cada pocillo e incubar durante la noche a 4 °C.
4. Retire los anticuerpos y agregue 100 μL de 1x PBS a cada pocillo para lavar las células. Retire 1 vez el PBS y repita el lavado 2 veces.
5. Para evitar el blanqueo de las moléculas fluorescentes, comience a trabajar en condiciones mínimas de luz. Diluir los anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia (1:400) en PBST. Añadir 50 μL de anticuerpos diluidos a cada pocillo e incubar a RT durante 1 h.
6. Retire la solución de anticuerpos y agregue 100 μL de 1x PBS a cada pocillo para lavar las células. Retire 1 vez el PBS y repita el lavado 2 veces.
7. Retirar 1x PBS, añadir 50 μL de 200 ng/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por pocillo para teñir los núcleos de las células cultivadas, e incubar a RT durante 10 min.
8. Lave las celdas 3 veces con 100 μL de 1x PBS durante 5 minutos cada una. Mantenga 100 μL de 1x PBS en cada pocillo después del último lavado. Cubra la placa con papel de aluminio y guárdela a 4 °C hasta obtener la imagen.
9. Imagen de neuronas embrionarias primarias de dopamina en una placa de visualización de 96 pocillos con un escáner de placas de alto contenido (ver Tabla de Materiales) equipado con un objetivo 10x.
10. Ajuste la configuración en función de las especificaciones de la placa de 96 pocillos, como el tipo de placa, el fabricante, el tamaño, la distancia entre pocillos, así como el tipo y la cantidad de medio.
11. Seleccione el área de imagen del pocillo para cubrir todas las celdas en una micro isla. Elige bien un ejemplo para ajustar el enfoque automático. Basar el enfoque inicial en DAPI.
12. Calibrar el tiempo de adquisición de cada canal fluorescente en función de la intensidad de la tinción en los pocillos de control. Ajustar los parámetros para que en los pozos de control tratados con PFF, se puedan distinguir claramente las células de dopamina que albergan agregados de pS129-αsyn en el soma celular, lo que permite una cuantificación inequívoca de las células pS129-αsyn positivas y pS129-αsyn negativas
    nota: Los pocillos que no contienen PFF no deben tener ninguna tinción para pS129-αsyn; por lo tanto, estos pozos se pueden utilizar como control negativo para ajustar la intensidad de pS129-αsyn.
13. Obtenga imágenes de todos los pocillos seleccionados con un objetivo de 10x simultáneamente para todos los canales con tinción de inmunofluorescencia con exactamente los mismos parámetros.
14. Opcionalmente, marque las inclusiones de α-sinucleína en un subconjunto de los pocillos con anticuerpos específicos para la α-sinucleína filamentosa para confirmar que los cambios en el número de inclusiones pS129-αsyn-positive reflejan la reducción en la acumulación de proteínas en lugar de la inhibición de la fosforilación o desfosforilación de pS129-αsyn.
15. Repita el paso 5.3, sustituyendo el anticuerpo pS129-αsyn por el anticuerpo de filamento de α-sinucleína (1:2.000). Imagine la α-sinucleína agregada teñida como en el paso 5.13.

Resultados

Figura 1: Disección del suelo del mesencéfalo de un embrión de ratón E13.5. (A) Los lugares de corte en el cuarto trasero de la cabeza están marcados con flechas negras y líneas discontinuas blancas. (B) La pieza fue extraída del resto del embrión. La pieza extraída se encierra en un círculo. (C) La pieza se giró 90° para mirar hacia la parte posteri...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.4% Tinción de Azul Trypan	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	15250061
Tubo de polipropileno CELLSTAR de 15 ml	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania	188261
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	10236276001
5 M HCl	N/A	N/A	Cocina multimedia, Instituto de Biotecnología, Universidad de Helsinki
5 M de NaOH	N/A	N/A	Cocina multimedia, Instituto de Biotecnología, Universidad de Helsinki
Placa de visualización de 96 pocillos (negro)	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos	6005182
99,5% Etanol (EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, Finlandia	N/A
Fluido siliconizante AquaSil	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	TS-42799
Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml esterilizado en autoclave	N/A	N/A	Cocina multimedia, Instituto de Biotecnología, Universidad de Helsinki
Dispositivo de sonicación Bioruptor	Diagenode, Lieja, Bélgica	B01020001
Solución salina equilibrada de Hank's (HBSS) libre de Ca2+, Mg2+	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	14175-053
Paquetes de software CellProfiler y CellAnalyst	N/A	N/A	Software gratuito de código abierto
centrífuga 5702	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania	5702000019
Incubadora de CO2	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	N/A
Cámara de recuento	BioRad Inc., Hércules, California, EE. UU.	1450015
Microscopio de ultra alta resolución DeltaVision con mesa de aire y gabinete	GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, EE. UU.	29254706
Desoxirribonucleasa-I (Dnasa I)	Roche, Basilea, Suiza	22098700
D-glucosa	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	G8769
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	21331–020
burro anti-ratón AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	A21202
burro anti-conejo AlexaFluor 647	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	A31573
burro anti-ovejas AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	A11015
El tampón de Dulbecco	N/A	N/A	Cocina multimedia, Instituto de Biotecnología, Universidad de Helsinki
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	10500056
Barra agitadora de PTFE Plain Economy de Fisherbrand	fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	11507582
Sistema de procesamiento de imágenes nano ImageXpress	Molecular Devices, San José, California, EE. UU.	N/A
L-glutamina	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	25030–032
monoclonal antitirosina hidroxilasa de ratón	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Alemán	MAB318
Suplemento de N2	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	17502–048
Suero de Caballo Normal	Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, Estados Unidos	S-2000
paraformaldehído (PFA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	158127
paraformaldehído en polvo, 95%	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	158127
pH-Fix, tiras indicadoras de color fijo	Macherey-Nagel, Düren, Alemania	92110
Tampón de fosfoato salino (PBS)	N/A	N/A	Cocina multimedia, Instituto de Biotecnología, Universidad de Helsinki
poli-L-ornitina	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	P4957
Primocina	InvivoGen, San Diego, California, EE. UU.	ant-pm-1, ant-pm-2
filamento monoclonal anti-alfa-sinucleína de conejo	Abcam, Cambridge, Reino Unido	AB209538
anti-fosfa-serina monoclonal de conejo129-alfa-sinucleína	Abcam, Cambridge, Reino Unido	AB51253
RCT Basic, Agitador Magnético IKA	IKA-Werke® GmbH, Staufen, Alemania	3810000
factor neurotrófico derivado de la glía humana recombinante (hGDNF)	PeproTech, Rocky Hill, NJ, EE. UU. o Prospec, Ness-Ziona, Israel	450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)
Fibrillas preformadas (PFF) de alfa sinucleína de ratón recombinante	N/A	N/A	Regalo del colaborador, Prof. Kelvin C Luk
Sistema de microscopio estereoscópico de investigación	Olympus Corporation, Tokio, Japón	SZX10
Policlonal antitirosina hidroxilasa ovina	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Alemán	AB1542
TC 20 Contador de células automatizado	BioRad Inc., Hércules, California, EE. UU.	1450102
Tritón X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	11332481001
tripsina	MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China	2199700