Estudio de la acumulación de alfa-sinucleína en neuronas dopaminérgicas embrionarias primarias de ratón

Abstract

Fuente: Er, S. et al., Estudio de la acumulación de α-sinucleína inducida por fibrillas preformadas en neuronas de dopamina del mesencéfalo embrionarias primarias de ratón.J. Vis. Exp. (2020).

Este video demuestra el proceso de cuantificación de la acumulación de alfa-sinucleína en neuronas embrionarias de dopamina de ratón pretratadas con fibrillas preformadas de alfa-sinucleína. Describe los pasos para fijar, teñir y cuantificar las neuronas dopaminérgicas que contienen agregados de alfa-sinucleína mediante inmunofluorescencia.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Preparación

1. Prepare medio neuronal dopaminérgico (DPM) con 0,46% de D-glucosa, 1% de L-glutamina, 1% de N2, 0,2% de primocina, completado con DMEM/F12. Filtre el DPM después de mezclar los ingredientes. Almacene DPM a 4 °C y caliente cada alícuota solo una vez.
   nota: El DPM no debe contener factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), ya que reducirá la acumulación de α-sinucleína en las neuronas dopaminérgicas.
2. Preparar pipetas de v....

Results

Figura 1: Disección del suelo del mesencéfalo de un embrión de ratón E13.5. (A) Los lugares de corte en el cuarto trasero de la cabeza están marcados con flechas negras y líneas discontinuas blancas. (B) La pieza fue extraída del resto del embrión. La pieza extraída se encierra en un círculo. (C) La pieza se giró 90° para mirar hacia la parte posteri.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Tinción de Azul Trypan	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	15250061
Tubo de polipropileno CELLSTAR de 15 ml	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania	188261
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	10236276001
5 M HCl	N/A	N/A	Cocina multimedia, Instituto de Biotecnología, Universidad de Helsinki
5 M de NaOH	N/A	N/A	Cocina multimedia, Instituto de Biotecnología, Universidad de Helsinki
Placa de visualización de 96 pocillos (negro)	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos	6005182
99,5% Etanol (EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, Finlandia	N/A
Fluido siliconizante AquaSil	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	TS-42799
Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml esterilizado en autoclave	N/A	N/A	Cocina multimedia, Instituto de Biotecnología, Universidad de Helsinki
Dispositivo de sonicación Bioruptor	Diagenode, Lieja, Bélgica	B01020001
Solución salina equilibrada de Hank's (HBSS) libre de Ca2+, Mg2+	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	14175-053
Paquetes de software CellProfiler y CellAnalyst	N/A	N/A	Software gratuito de código abierto
centrífuga 5702	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania	5702000019
Incubadora de CO2	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	N/A
Cámara de recuento	BioRad Inc., Hércules, California, EE. UU.	1450015
Microscopio de ultra alta resolución DeltaVision con mesa de aire y gabinete	GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, EE. UU.	29254706
Desoxirribonucleasa-I (Dnasa I)	Roche, Basilea, Suiza	22098700
D-glucosa	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	G8769
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	21331–020
burro anti-ratón AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	A21202
burro anti-conejo AlexaFluor 647	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	A31573
burro anti-ovejas AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	A11015
El tampón de Dulbecco	N/A	N/A	Cocina multimedia, Instituto de Biotecnología, Universidad de Helsinki
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	10500056
Barra agitadora de PTFE Plain Economy de Fisherbrand	fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	11507582
Sistema de procesamiento de imágenes nano ImageXpress	Molecular Devices, San José, California, EE. UU.	N/A
L-glutamina	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	25030–032
monoclonal antitirosina hidroxilasa de ratón	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Alemán	MAB318
Suplemento de N2	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.	17502–048
Suero de Caballo Normal	Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, Estados Unidos	S-2000
paraformaldehído (PFA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	158127
paraformaldehído en polvo, 95%	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	158127
pH-Fix, tiras indicadoras de color fijo	Macherey-Nagel, Düren, Alemania	92110
Tampón de fosfoato salino (PBS)	N/A	N/A	Cocina multimedia, Instituto de Biotecnología, Universidad de Helsinki
poli-L-ornitina	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	P4957
Primocina	InvivoGen, San Diego, California, EE. UU.	ant-pm-1, ant-pm-2
filamento monoclonal anti-alfa-sinucleína de conejo	Abcam, Cambridge, Reino Unido	AB209538
anti-fosfa-serina monoclonal de conejo129-alfa-sinucleína	Abcam, Cambridge, Reino Unido	AB51253
RCT Basic, Agitador Magnético IKA	IKA-Werke® GmbH, Staufen, Alemania	3810000
factor neurotrófico derivado de la glía humana recombinante (hGDNF)	PeproTech, Rocky Hill, NJ, EE. UU. o Prospec, Ness-Ziona, Israel	450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)
Fibrillas preformadas (PFF) de alfa sinucleína de ratón recombinante	N/A	N/A	Regalo del colaborador, Prof. Kelvin C Luk
Sistema de microscopio estereoscópico de investigación	Olympus Corporation, Tokio, Japón	SZX10
Policlonal antitirosina hidroxilasa ovina	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Alemán	AB1542
TC 20 Contador de células automatizado	BioRad Inc., Hércules, California, EE. UU.	1450102
Tritón X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	11332481001
tripsina	MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China	2199700