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1. Micromezcla una reacción RT
- Antes de realizar una reacción de RT con micromezcla, equilibrar la micromixer a la temperatura deseada de la reacción de RT.
- Coloque el micromixer dentro de 37 ° C (o la temperatura recomendada por el proveedor RT) incubadora de al menos 1 hora antes del inicio de la reacción de RT.
- Establecer la mezcla de RT de acuerdo con el proveedor de la transcriptasa inversa de (por ejemplo, MMTV-RT de Promega, Omniscript de Qiagen) instrucciones, excepto el uso de una sola célula cantidades de ARN total de entrada (por ejemplo, 0.1-1pg/μl), en lugar de la g-ng cantidades recomendadas por los proveedores.
- Utilizamos estándar estéril, libre de nucleasa 200μL tubos de pared delgada PCR.
- Posición RT tubos firmemente en la micromixer tan pronto como estén listos para mezclar. El micromixer debe permanecer dentro de la incubadora a 37 ° C durante la duración de la reacción de RT.
- Seleccione la frecuencia adecuada y la amplitud de micromezcla. En este ejemplo vamos a usar 150Hz.
- Cambiar el micromixer adelante y dejar actuar durante toda la duración de la reacción de RT (60 minutos).
- Cambiar el micromixer fuera y tomar los tubos RT una vez que la reacción de RT se ha completado.
- Coloque los tubos de RT en el hielo y continuar de forma normal con otras aplicaciones como la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR o PCR en tiempo real).
2. Los resultados representativos:
El beneficio de micromezcla en el contexto de las reacciones de RT es un aumento en el rendimiento de cDNA en relación con los otros métodos de mezcla (por ejemplo, temblores, agitación o trituración) se utilizan. Esto se puede ver, por ejemplo, en el análisis posterior de los cDNA utilizando cuantitativa de reacción en cadena de la polimerasa (PCR cuantitativa o PCR en tiempo real). Figura 2A muestra los efectos de micromezcla durante los primeros 5 minutos (azul, "micromixed5") o la totalidad de 60 minutos (de color rojo, "micromixed60"), en comparación con la trituración de la reacción de RT inmediatamente antes de la incubación RT (negro, "trituración" ). En este caso el volumen de la anterior reacción de RT se 25μL y contenía 2.5pg de ARN total. rastros qPCR utilizando los primers diseñados para detectar cDNA Nurr-1 representa ARNm se muestra arriba, y las medias ± SEM del número de ciclos para alcanzar el 50% máximo de fluorescencia en 3 repeticiones de este mismo experimento se representan a continuación. El asterisco indica una diferencia estadísticamente significativa (ANOVA de un factor con comparaciones múltiples de Tukey). Tenga en cuenta que micromezcla para los primeros 5 minutos de la anterior reacción RT producido una mejora no significativa en la trituración, mientras que para toda la micromezcla 60 minutos de la anterior reacción RT producido una mejora significativa en la trituración, la magnitud de lo que equivale a aproximadamente el 15 qPCR ciclos, en promedio.
El beneficio de micromezcla también se puede ver en análisis de la curva de fusión de los productos obtenidos qPCR posteriores. En el experimento ilustrado en la Figura 2B, micromezcla para todo el 60 minutos de la anterior reacción RT dio lugar a una señal de qPCR consistente en duplicados de las muestras (Figura 2Ba, 2 rastros de color rojo), mientras que micromezcla durante los primeros 5 minutos o trituración sólo se produce qPCR inconsistente rastros (Figura 2Ba, dos azules y dos rastros rastros negro, respectivamente). Las huellas grises son los controles negativos ("neg.") En el que cDNA fue dejado fuera de la reacción de qPCR. Cuando los productos qPCR de este experimento fueron desnaturalizados por la rampa de su temperatura (es decir, análisis de la curva de fusión), era evidente que los productos de PCR apropiada (es decir, una amplificación que era idéntica a la obtenida en concentraciones mucho más elevadas de ARNm se transcribe inversa y amplificado por PCR cuantitativa, datos no mostrados) sólo estaban presentes las siguientes reacciones de RT que se había micromixed durante 60 minutos (Figura 2Bb, 2 rastros de color rojo). Todos los demás (es decir, micromixed5, trituración y controles negativos) generado productos alternativos de amplificación (por ejemplo, dímeros de primers).
Figura 1. Diagrama de flujo del protocolo para la aplicación de micromezcla a métodos de laboratorio las reacciones de RT. Descripciones más detalladas de los principios físicos involucrados, micromixer y cómo construir un micromixer de la casa se proporcionan en las referencias 13,14
Figura 2. Representante qPCR datos que ilustran los beneficios de micromezcla se aplica a las reacciones de RT anterior que comprende una sola célula cantidades de ARNm de otra manera estándar de laboratorio las reacciones de RT. Un ejemplo de las huellas qPCR detección de ARNm cDNA que codifica para la representación de Nurr-1 gen. Lo anterior reacciones de RT contiene 2.5pg de ARN total en un volumen de 25μL y se llevaron a cabo en una incubadora a 37 ° C durante 60 minutos. RT reacciones fueron mezclados por trituración de la RT mezcla antes de la incubación (huellas negro "trituración"), micromixed durante los primeros 5 minutos de la reacción RT (huellas azules ", micromixed5") o para toda la micromixed 60 minutos de la reacción RT (trazas rojas ", micromixed60" ). Media ± SEM del número de ciclos de PCR cuantitativa para llegar al 50% máximo de fluorescencia se representan a continuación para n = 3 repeticiones de este experimento. El asterisco indica una diferencia significativa (ANOVA de un factor con comparaciones múltiples de Tukey). B Otro experimento qPCR examinar Nurr-1 cDNA producto, esta vez después de las reacciones de RT contiene 25pg de ARN total en un volumen de 25μL. rastros qPCR (a), así como análisis de la curva de fusión de los productos obtenidos qPCR (b) se muestran las condiciones de mezcla diferentes. Los controles negativos en los que no cDNA fue incluido en la anterior reacción RT también se incluyen (los rastros grises ", neg."). Reacciones de RT con concentraciones mucho más elevadas de ARNm se realizaron y produjeron picos de la curva de fusión (datos no mostrados) idénticas a las de (b) para micromixed60 (trazas rojas) muestras.