La separación de una sola hebra de ADN, el ADN de doble cadena y el ARN de una comunidad ambiental viral mediante cromatografía de hidroxiapatita

Resumen

Se describe un método eficiente para separar ADN de cadena sencilla, doble cadena de ADN y las moléculas de ARN viral de las comunidades del medio ambiente. Los ácidos nucleicos son fraccionados utilizando cromatografía de hidroxiapatita con una creciente concentración de fosfato que contienen buffers. Este método permite el aislamiento de todos los tipos de ácido nucleico viral de las muestras ambientales.

Resumen

Los virus, particularmente los bacteriófagos (fagos), son las entidades biológicas más numerosas en ^1,2 la Tierra. Los virus modulan la abundancia de la célula huésped y la diversidad, contribuir a los ciclos de los nutrientes, alterar anfitrión fenotipo de las células, y la influencia de la evolución de la célula huésped y de las comunidades viral a través de la transferencia lateral de genes ^3. Numerosos estudios han puesto de relieve la asombrosa diversidad genética de los virus y su potencial funcional en una variedad de ambientes naturales.

Técnicas de metagenómica se han utilizado para estudiar la diversidad taxonómica y el potencial funcional de los complejos conjuntos viral cuyos miembros contienen ADN de cadena sencilla (ssDNA), el ADN de doble cadena (dsDNA) y los genotipos de ARN ^4-9. Los protocolos actuales de construcción de la biblioteca para estudiar el medio ambiente que contienen ADN o ARN que contienen los virus requieren un tratamiento inicial de la nucleasa con el fin de quitar las plantillas no focalizados a ^10. Sin embargo, una comprensión global de la dotación genética colectiva de la comunidad de virus y la diversidad del virus requiere el conocimiento de todos los miembros, independientemente de la composición del genoma. Fraccionamiento de ácidos nucleicos purificados subtipos proporciona un mecanismo eficaz para que el estudio conjuntos viral sin tener que sacrificar una parte de la firma genética de la comunidad.

Hidroxiapatita, una forma cristalina de fosfato de calcio, se ha empleado en la separación de los ácidos nucleicos, así como las proteínas y los microbios, desde 1960 ^11. Mediante la explotación de la interacción de cargas entre la carga positiva iones Ca ^{2 +} de la hidroxiapatita y el esqueleto de fosfato con carga negativa de los subtipos de ácidos nucleicos, es posible eluir preferentemente cada subtipo de ácidos nucleicos independiente de los demás. Recientemente hemos empleado esta estrategia de forma independiente a fraccionar los genomas de ssDNA, dsDNA y los virus que contienen ARN en la preparación de la secuenciación del ADN ^12. A continuación, presentamos un método para el fraccionamiento y la recuperación de ssDNA, dsDNA y el ARN viral ácidos nucleicos de los conjuntos mixtos viral mediante cromatografía de hidroxiapatita.

Protocolo

1. Preparación de las soluciones

Antes de realizar la cromatografía de hidroxiapatita, tampones de fosfato debe estar preparado y la hidroxiapatita debe estar correctamente hidratado.

1. Solución de fosfato 1 M, pH 6,8: En un matraz de 1 litro se disuelven 119.98g de fosfato de sodio monobásico en 1 litro de agua estéril, tratada con DEPC H ₂ O. Prepare un fosfato de sodio dibásico 1M solución en un frasco de 1 litro de disolución 141.96g de fosfato de sodio dibásico en 1 litro de agua estéril, tratada con DEPC H ₂ O. Combine los mono-y di-solución en una proporción de 1:1. Lugar matraz en una placa de agitac....

Discusión

La metodología de la cromatografía de hidroxiapatita que aquí se presenta es una herramienta muy eficiente y robusto para el fraccionamiento de los ácidos nucleicos de los conjuntos mixtos viral, cuando el objetivo es el estudio de la composición total de ácidos nucleicos de la comunidad. Por lo general, ssDNA, el ARN y ADN de doble cadena se eluyen de la columna de las concentraciones de pho tampón fosfato mayor que 0 y 0,40 m aproximadamente ~ respectivamente. Sin embargo, cada preparación de hidroxiapatita p.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del Material	Empresa	Número de catálogo	Número de catálogo
Econo-Columna	Bio-Rad	737-0717	0.7cm paquete de ID / 2
Hidroxiapatita	Bio-Rad	130-0520	Grado de ADN de Bio-Gel Gel HTP, 100g/td>
El fosfato de sodio, monobásico	VWR	VW1497-01	Monohidrato, cristal 500g
Fosfato sódico, dibásico	VWR	VW1496-01	Anhidro, en polvo de 500 g
El agua tratada con DEPC	Invitrogen	AM9922	1L
10% SDS solución	Invitrogen	24730-020	UltraPure, 1L
0,5 M EDTA	Invitrogen	AM9262	pH 8,0, 1 litro
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML
2 ml serológicas pippette	VWR	89130-884	Poliestireno, estéril
BD Falcon Tubos de centrífuga	VWR	21008-936	15 ml, estéril
Fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1 v / v / v)	Invitrogen	15593-031	UltraPure, 100ml
Amicon Ultra-4 dispositivos centrífugos	Millipore	UFC803024	Ultracel-30 de membrana
20X buffer TE, RNasa libre	Invitrogen	T11493	100ml
Glycoblue	Invitrogen	AM9516	15mg/ml