Generación de una oclusión de la arteria cerebral media en una cría de rata para inducir isquemia cerebral local

Resumen

Fuente: Larpthaveesarp, A., et. al. Modelo de oclusión transitoria de la arteria cerebral media del accidente cerebrovascular neonatal en ratas P10. J. vis. exp. (2017)

Este video muestra el establecimiento del modelo de oclusión de la arteria cerebral media en una cría de rata. La arteria carótida interna (ACI) queda expuesta y se asegura una ligadura para restringir el flujo sanguíneo. Se inserta un ocluso a través de la ICA para llegar a la arteria cerebral media. A continuación, se permite que el cachorro se recupere antes de un análisis más detallado.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Oclusión de la arteria cerebral media

1. Pesa al cachorro y asegúrate de que tiene el peso adecuado (19-21 g). Anestesiar al cachorro con isoflurano al 3% y oxígeno (_O2) al 100% y asegurarse de que no haya respuesta a un pellizco en el pie. Mantener la temperatura de la superficie corporal entre 35,5 °C y 37 °C con el uso de una almohadilla térmica debajo de la etapa quirúrgica.
2. Asegure al animal en posición supina con cinta adhesiva en las regiones de los hombros. Utilizando hisopos de algodón estériles, frote el área cervical anterior con una solución de povidona yodada seguida de un hisopo de etanol al 70% en agua bidestilada, alternando entre cada solución para cuatro hisopos en total.
3. Infiltrar localmente bupivacaína al 0.25% en el sitio de incisión planeado. Con un estereoscopio, haga una incisión cervical anterior de 5 a 7 mm en la línea media para exponer la arteria carótida común (ACC). Coloque de 2 a 4 retractores para mantener la cavidad abierta y la arteria expuesta.
4. Localiza la arteria carótida interna (ACI), la arteria occipital (OA) y la arteria carótida externa (ECA). Cepille las arterias para obtener una visión clara. Tenga cuidado de no alterar el nervio vago.
   NOTA: Para los cachorros operados simuladamente, la incisión se deja abierta y las arterias quedan expuestas, después de lo cual la incisión se sutura para cerrarla. El tiempo total de anestesia es equivalente al de la cirugía de oclusión.
5. Corta 1,5 cm de hilo de sutura trenzado de seda 6-0. Trenza la sutura, sacando las hebras individuales. Asegúrate de que las hebras individuales estén limpias y no deshilachadas.
   NOTA: Si es necesario, alise las puntas deshilachadas sumergiendo la hebra individual en agua estéril y cepillando la hebra con las puntas de las pinzas.
6. Mientras sostiene la hebra de sutura con pinzas de 45 grados, mueva las pinzas en un movimiento de arco de barrido para pasar por debajo del ICA de modo que las puntas de las pinzas emerjan entre el ICA y el OA.
   NOTA: Si la disección está bien hecha, este paso será relativamente fácil. Si el ICA y el OA se tocan, tenga cuidado de no romper las arterias cuando use las pinzas para aislar el ICA. Si se produce sangrado, aplique presión a la arteria con las pinzas hasta que se detenga. Absorba la sangre con un hisopo estéril.
7. Agarra el extremo de la hebra de sutura que está sujeta por las pinzas y tira de él para que el extremo sea de fácil acceso. Suelte la hebra de las pinzas y retroceda hacia afuera desde debajo de la ICA, invirtiendo el movimiento en el paso 1.5 (Figura 1A).
8. Ata una ligadura temporal alrededor del ICA en la base, más cerca de donde se separa del CCA.
   NOTA: Es importante atar el nudo de modo que el extremo de la hebra que se tirará para quitar el nudo sea lo suficientemente largo (mayor de 1 mm, menos de 3 mm) para agarrar fácilmente con pinzas mientras se asegura de que haya una cantidad adecuada de hebra de sutura en el otro lado del nudo para la retracción.
9. Retraiga cuidadosamente el ICA lateralmente y use un clip para asegurar el mechón al exceso de piel cerca de la región de la axila en el lado opuesto a la incisión. Asegúrese de que esta hebra retráctil esté lo suficientemente tensa como para detener el flujo sanguíneo antes de continuar con el siguiente paso para minimizar el riesgo de sangrado incontrolado. Observe que la arteria es plana y pálida.
   NOTA: No se retraiga demasiado, ya que puede causar un desgarro parcial o completo del ICA. La retracción se puede ajustar justo antes de realizar la arteriotomía tirando de la hebra en el lado opuesto al clip.
10. Utilice pinzas de 45° para agarrar otra hebra de sutura sin trenzar y enrollarla debajo y alrededor del ICA, como en el paso 1.5. Coloque esta hebra lateral a la hebra de retracción (Figura 1B).
    NOTA: Este paso también se puede realizar antes de la retracción. Si no está seguro de la calidad de la retracción, este nudo se puede atar muy sin apretar antes del siguiente paso.
11. Corta una arteriotomía de 0,2 mm a medio camino entre las ligaduras atadas y desatadas, errando más cerca de la ligadura atada.
    NOTA: La sangre que queda en la arteriomía puede vaciarse a través de la arteriotomía, pero no debe exceder los 5 μL. Si el sangrado persiste, tire con cuidado de la hebra de retracción para aumentar la retracción, con cuidado de evitar dañar la arteria por una tensión excesiva.
12. Usando una regla métrica, mida la sutura oclusiva y corte la sutura con un margen adicional de 2-3 mm para eliminar el oclusor durante la reperfusión. Sostenga el oclusor con pinzas de 45 grados y use pinzas rectas para crear una curva a la longitud adecuada para alcanzar el MCA, marcando un punto de parada para avanzar.
    NOTA: Se utiliza una longitud de oclusión de 10 mm desde el extremo de la punta de silicona hasta la curva para las crías de rata postnatal o P-10 Sprague Dawley o Long Evans en este rango de peso.
13. Con pinzas de 45°, introduzca la sutura de oclusión de nylon recubierta de silicona en la arteriotomía y avance la sutura hasta la curva que marca la distancia predeterminada al MCA (Figura 1C). Asegúrese de que el avance se sienta suave; Detenga inmediatamente el avance si se siente resistencia. Durante el avance, apunte la sutura en una dirección paralela al CC/ECA, hacia la cabeza.
    NOTA: Si la sutura avanza dorsalmente hacia la columna vertebral del animal, puede chocar con la arteria pterigopalatina. Si se siente resistencia después de 3-5 mm de avance, la sutura ha golpeado la unión PTA. Retire el oclusor de la arteria hasta que la cabeza de silicona esté cerca de la arteriotomía antes de ajustar la dirección de avance. No es necesario retirar completamente el oclusor de la arteriotomía.
14. Asegure el oclusor atando una ligadura temporal usando la hebra del paso 1.10 (Figura 1D).
15. Elimina el clip retractor. Recorta las hebras de ambas ligaduras temporales de modo que la hebra del nudo que se tira para quitar el nudo sea fácil de agarrar con pinzas rectas y sea más larga que la hebra que se tira para apretar el nudo.
    NOTA: Las hebras deben ser lo suficientemente cortas para que no se enreden en la cavidad después del cierre.
16. Retire los retractores y cierre la cavidad con seda trenzada 6-0 para crear tres o cuatro suturas interrumpidas.
17. Retire al cachorro de la anestesia y colóquelo en una almohadilla térmica en el aire de la habitación. Monitoree al cachorro hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esteral y asegúrese de que se haya recuperado por completo antes de devolverlo a la madre. Asegúrese de que el cachorro mantenga una temperatura de la superficie corporal entre 35,5 °C y 37 °C.

Resultados

Figura 1: Imágenes quirúrgicas en vivo del procedimiento de tMCAO. (A) La primera hebra de sutura se enrolla alrededor de la ICA, como se detalla en el paso 1.6. (B) Se ata la primera ligadura temporal y se retrae el ICA. La segunda hebra de sutura se enrolla alrededor de la ICA, lateral a la primera hebra de sutura, como se detalla en el paso 1.9. (C

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Isoflourane	Henry Schein	50033	Anesthetic, at 3%
Trinocular Surgioscope	World Precision Instruments	PSMT5N
Heating pad	Sunbeam	000731-500-000	Ajuste
IR Thermometer	Extech Instruments	72-5270
Kit de retracción para animales pequeños	Fine Science Tools	18200-20
CermaCut Scissors	Fine Science Tools	14958-09
Pinzas de #5SF Dumont	Fine Science Tools	112522-00	2x
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35	2x
B-2 Micro Clamp	Fine Science Tools	00398-02
Forcepts for Clamp Application	Fine Science Tools	00072-14
Micro Vannas Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2mm borde
Occlusion Sutures	Doccol	602123PK10	701712PK5Re
Ruler	Fine Science Tools
6-0 Corte Revertido de Seda Perma-HandSuturre<	769G
Euthasol	Virbac	710101	0.22 ml/kg
Aplicadores con punta de algodón	Henry Schein	100-9249
Laboratory Tape	VWR	89097-990

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