Preparación de plasma rico en plaquetas de sangre periférica humana

Resumen

Este video muestra la preparación de plasma rico en plaquetas (PRP) de alta calidad mediante la detección del recuento de plaquetas, la recolección y centrifugación de sangre y el aislamiento de plaquetas. Este PRP se utiliza en aplicaciones terapéuticas para la regeneración y cicatrización de tejidos.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Sample collection

1. Examina a los pacientes utilizando hemogramas preliminares para descartar trombocitopenia y establecer recuentos celulares basales. Para hacer esto, use un hemocitómetro de grado clínico para el recuento de células. Asegúrese de que los recuentos de plaquetas estén por encima de 150.000 células/μL.

2. Asegúrese de que el paciente esté bien hidratado antes de la recolección de la muestra. Esto podría garantizarse mediante la inspección visual de la lengua, la turgencia de la piel y la medición de la presión arterial.

3. Recoja 100 mL de sangre venosa periférica de la vena antecubital del paciente utilizando 2 jeringas de 50 mL llenas con 5 mL de anticoagulante Acid-Citrate-Dextrosa-Adenina (ACDA) en una proporción de 1:10. Incline las jeringas recolectadas para mezclar adecuadamente el anticoagulante y evitar la coagulación de la muestra de sangre antes de continuar con el siguiente paso.
   NOTA: La extracción lenta de sangre puede resultar en una mezcla inadecuada de la sangre recolectada con el anticoagulante y la coagulación; por lo tanto, use una cánula mínima de 18G para la recolección de sangre.

4. Transfiera 100 mL de sangre en las jeringas a tubos de centrifugación de fondo cónico de 15 mL con 10 mL en cada tubo.

2. Centrifugación y aislamiento

1. Coloque los tubos de centrifugación en una máquina de centrifugación de mesa de grado clínico mantenida a temperatura ambiente en un ambiente estéril y ejecute el centrifugado suave inicial a una velocidad de 100 x g durante 15 min. La sangre anticoagulada se separa en tres capas, es decir, glóbulos rojos en la parte inferior, plasma en la parte superior y capa leucocitaria en el medio.

2. Pipetea la capa superior de la muestra de tres capas de forma estéril utilizando una aguja espinal estéril de 18G y recógela en un tubo de centrifugación inferior cónico separado. Asegure tubos individuales por cada 10 mL de plasma recolectado.
   NOTA: La decisión de incluir la capa leucocitaria depende de la naturaleza del plasma rico en plaquetas que estamos tratando de aislar, que a su vez depende de la naturaleza de su aplicación clínica. Si el PRP pobre en leucocitos es el producto deseado, absténgase de incluir la capa de capa leucocitaria, mientras que si el PRP rico en leucocitos es el producto deseado, entonces la capa de plasma superior junto con la capa leucocitaria se pipetea para la segunda ronda de centrifugación.

3. Someta el plasma recolectado en tubos de centrifugación de 15 mL con 10 mL de plasma cada uno a una centrifugación de espín duro a 1600 x g durante 20 min. Las plaquetas presentes en el gránulo de plasma en el fondo del tubo de ensayo. Recoja el sobrenadante en un tubo aparte.

4. Pipetea el pellet de plaquetas en una jeringa de 5 mL con la ayuda de una aguja espinal estéril de 18 G. Recoja todos los tubos de ensayo con gránulos en una sola jeringa de 5 ml para su aplicación.

5. Reconstituya el pellet recolectado con volúmenes suficientes para uso clínico con el plasma sobrenadante en el tubo de centrifugación después de la segunda ronda de centrifugación.

3. Validation

1. Someta el PRP final preparado al recuento celular utilizando un hemacitómetro de grado clínico para calcular el recuento de plaquetas y calcular el recuento absoluto de plaquetas en el PRP, el gradiente de concentración de plaquetas logrado sobre la línea de base y la eficacia de recuperación de plaquetas del protocolo utilizando la siguiente fórmula.
   Recuento absoluto de plaquetas = recuento de plaquetas del PRP en μL x 1000 x volumen de PRP en mL
   Gradiente de concentración de plaquetas =
   Eficiencia de recuperación de plaquetas =
   Por ejemplo, se utilizan 100 mL de sangre con un recuento basal de plaquetas de 200.000/μL para la preparación de PRP, y 5 mL de PRP con un recuento final de plaquetas de 3.000.000/μL. Los parámetros mencionados anteriormente se calculan de la siguiente manera:
   Recuento absoluto de plaquetas = 3,000,000 x 1000 x 5 = 15 mil millones de plaquetas
   Gradiente de concentración de plaquetas = 3,000,000 / 200,000 = 15
   Eficiencia de recuperación de plaquetas = 3,000,000 x 1000 x 5 / 200,000 x 1000 x 100 = 75%

2. Garantizar la eficiencia de recuperación del protocolo a través de ciclos repetidos. Un protocolo eficaz utilizado ofrece un gradiente de concentración superior a 5 veces la línea de base con una eficiencia de recuperación del >80%. En función del uso deseado del volumen de PRP, los recuentos de plaquetas que deben administrarse se pueden ajustar en consecuencia.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de dextrosa citrato anticoagulante IP	Fresenius Kabi, India	ACDAIP/L/A/19/00
BD Aguja Quincke	Becton Dickinson, España	405125	18G
DISPOVAN Jeringa de 50 ml	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd, India
DISPOVAN Jeringa de 5 ml	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd, India
Spinwin Tubo Fondo Cónico	Tarsons, India	546021
Sysmex XN-350	Sysmex Inc., Estados Unidos	XN 350
Máquina de centrifugación clínica de mesa	REMI, India	R-8C	4x4 rotor oscilante de pozo