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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Cribado de secciones para detectar la presencia de placas teñidas con metoxi-X04
- Con la ayuda de un atlas estereotáxico del cerebro de ratón, seleccione secciones del cerebro que contengan la región de interés, por ejemplo, el hipocampo CA1 como se utiliza en el presente ejemplo. Coloque cada sección en un pocillo dentro de una placa de cultivo de 24 pocillos que contenga suficiente solución crioprotectora para evitar que las secciones se sequen.
- Examine cada sección sucesivamente para evitar que se sequen utilizando el siguiente procedimiento:
- Agregue una gota de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a un portaobjetos de microscopio con una pipeta desechable y coloque la sección sobre la gota.
- Examine la sección bajo un microscopio fluorescente para identificar las regiones que contienen placas Aβ marcadas con metoxi-X04.
Nota: el metoxi-X04 se puede visualizar fácilmente utilizando un filtro ultravioleta (UV) de fluorescencia (excitación de 340 a 380 nm).
- Capture imágenes de regiones de interés (ROI) en campo claro, así como en modo de fluorescencia sin mover la platina del microscopio, ya que cada imagen debe mostrar la misma región en ambos campos para correlacionar la presencia de las placas directamente con la región estructural de la sección de tejido.
- Guarde y asigne un nombre a las imágenes tomadas de acuerdo con el número de animal. También registre el número de pocillo en la placa y el campo de las fotografías tomadas. Por ejemplo, Ej: 9978A1B; Número de animal: 9978; Número de pozo: A1; Campo: Brillante. Vuelva a colocar la sección en su pocillo designado una vez que se hayan completado las imágenes.
Nota: Al final, para cada sección examinada, se obtienen dos imágenes, una en campo claro y otra en campo UV. - Abra las dos imágenes del mismo ROI (una en campo claro y la otra en campo UV) en Image J y, con el complemento MosaicJ, alinee los bordes de las dos imágenes y guarde la imagen alineada y combinada de acuerdo con el número de pozo del que provino.
- Guarde la imagen en una carpeta separada con el número del animal en particular. Combine las imágenes para identificar y localizar las placas en la sección de tejido y tenga una vista completa de toda la sección en los dos campos diferentes (brillante y UV).
- Una vez finalizado el proceso de cribado, almacene las secciones examinadas a -20 °C en una placa de cultivo de 24 pocillos que contenga crioprotector hasta que se lleve a cabo la inmunotinción o el procesamiento posterior.