Aislamiento y Caracterización de Hoechst Baja CD45 Negativo Mouse células madre mesenquimales de pulmón

Summary

En este artículo se demuestra el aislamiento de las células del pulmón murino residentes madre mesenquimales (MSC pulmón), su expansión, la caracterización y análisis de las propiedades inmunomoduladoras.

Abstract

Las células madre mesenquimales de tejido residente (MSC) son importantes reguladores de la reparación de tejidos o la regeneración, fibrosis, inflamación de la angiogénesis y la formación de tumores. En conjunto, estos estudios sugieren que el MSC pulmón residentes juegan un papel en la homeostasis del tejido pulmonar, lesión y reparación en enfermedades como la fibrosis pulmonar (PF) y la hipertensión arterial (PAH). Aquí se describe una tecnología para definir una población de MSC pulmón residente. La definición de esta población en el tejido pulmonar in vivo utilizando un conjunto de marcadores definir facilita el aislamiento repetido de una población de células madre bien caracterizada por citometría de flujo y el estudio de un tipo específico de célula y la función.

Protocol

1. Aislamiento de pulmón

1. Sacrificio de los ratones adultos (8-10 semanas de edad, 18 a 20 g; C57Bl6J) los ratones con una sobredosis de isoflurano seguido por exanguinación mediante una técnica estéril. Perfiles pueden variar ligeramente entre las cepas.
2. Extraer quirúrgicamente el diafragma, abrir la cavidad torácica por el corte de la caja torácica lateralmente a cada lado del ratón. Lavar la sangre de los pulmones por perfusión del ventrículo derecho del corazón con cuidado usando 3-5ml de tampón fosfato salino (PBS).
3. Diseccionar los lóbulos pulmonares de retirar la tráquea, los bronquios grandes y colocar en una placa de Petri llena de solución salina tamponada Hanks (HBSS). Tras la recolección de todos los lóbulos pulmonares con fórceps se utilizan para colocar el tejido en la tapa del plato. El tejido se picada en trozos pequeños con bisturí desechable, con suficiente líquido para mantener la humedad, pero no tanto que flotan y se mueven.
4. La disección de un miembro posterior de uno de los ratones y aislar la médula ósea para su uso como un control de tinción para establecer la flow citometría de puertas. Mancha de la médula ósea (MO) como se describió anteriormente ^1.

2. Preparación de una suspensión de células individuales del tejido pulmonar

1. Cada pulmón se digiere con un peso del tejido optimizado en relación al volumen de 0,2 g: 5ml de pre-calentado 0,2% Worthington tipo 2 colagenasa (Worthington Bioquímicos, Lakewood, NJ, cat # LS004202) disuelto en HBSS estéril. La mezcla se sumerge en un baño de agua 37 ° C durante 30 min ^2,3.
2. Triturar la muestra bien hasta que digerir el tejido pulmonar fluye fácilmente a través de una pipeta de 10 ml (aproximadamente 10 repeticiones). Incubar durante otros 15 minutos a 37 ° C para completar el tejido digiere y se asegura una suspensión de células individuales más uniforme.
3. Diluir la suspensión de células de pulmón con HBSS y triturar con una pipeta de 5 ml para dispersar fragmentos residuales del tejido.
4. Filtrar la suspensión utilizando un colador para eliminar células 70μM fragmentos sin digerir el tejido. Muestra se puede dividir en multipltubos cónicos e en este punto para evitar la sobrecarga de un colador celular y disminuir el tiempo.
5. Pellet la suspensión celular durante 10 minutos a 1500 rpm y se decanta el sobrenadante.
6. Resuspender el sedimento celular suavemente con la temperatura ambiente RBC tampón de lisis (eBiosciences, San Diego, CA, cat # 00-4333-57) e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir un volumen igual de HBSS para desactivar el buffer de lisis y el filtro de la suspensión celular de células utilizando un colador para eliminar los restos 40μM y agregados de células.
7. Pipeta 10μl de cada muestra que se tiñen y contar el número de células, tanto para el pulmón y muestras BM utilizando un hemocitómetro. Nota: El registro del volumen total de las células.
8. Pellet la suspensión de células individuales de las células del pulmón por centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos.
9. Resuspender los pulmones y las células BM en 1x10 ⁶ células / ml en precalentado (37 ° C) + DMEM (Dulbecco modificado de Eagle medio, alto nivel de glucosa (Gibco, Carlsbad, CA, cat # 11965-092) que contiene 2% fetal BOVIne suero (FBS) y HEPES 10 mM.
10. Preparar una solución de 1mg/ml de colorante Hoechst 33342 (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, cat # B2261) en el agua y el filtro de esterilización de ^1,4. El colorante Hoechst se puede almacenar en alícuotas a -80 ° C.
11. Agregar colorante Hoescht 33342 a una concentración final de 5μg/ml (una dilución de 200 veces de un depósito 1mg/ml) a la suspensión de células individuales.
12. Mezclar suavemente las células por la inversión e incubar a 37 ° C baño de agua durante exactamente 90 minutos.

3. Tinción y preparación de la suspensión de pulmón de células para el análisis de citometría de flujo

1. Después de 90 minutos todas las medidas con las células del pulmón Hoechst manchadas deben ser ejecutados a 4 ° C o en hielo para evitar flujo de salida de medio de contraste. Que sedimenten las células por centrifugación a 1500 rpm durante 10 min a 4 ° C y se resuspenden las células en helado tinción de amortiguación (PBS 2% de SFB).
2. Resuspender las células a una concentración de no más de 1x10 ⁷

1. >

&

Discussion

Hemos adaptado un método inicialmente usado para identificar BM células hematopoyéticas para aislar a una población específica de MSC pulmón residente. Debido a la reproducibilidad de aislamiento de estas células fueron entonces bien caracterizados como MSC. Su origen se ha definido como residente en el pulmón de ratones adultos (a diferencia de BM derivados) y un perfil fenotípico y molecular documentado ^2. La capacidad de aislar repetidamente esta población caracterizada permite el estudio más de la importancia biológica y el papel del MSC de pulmón durante la homeostasis del tejido y la enfermedad. La reciente definición de esta población en vivo en el tejido pulmonar, tanto murinos y humanos facilita el desarrollo de una estrategia terapéutica dirigida a rescatar a las células endógenas para facilitar la reparación de pulmón durante la lesión y la enfermedad.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Tampón fosfato salino (PBS)	Sigma	P-5368
Hanks solución salina tamponada (HBSS)	Thermo Scientific	SH30588.01
0,2% Worthington tipo 2 colagenasa	Worthington Bioquímicos	LS004202
Glóbulos rojos tampón de lisis	eBiosciences	00-4333-57
DMEM	Invitrogen Gibco	11965-092
Colorante Hoechst 33342	Sigma	B2261
CD45-APC	BD Pharmingen	559864
Yoduro de propidio	Sigma	81845
a-MEM	Thermo Scientific	SH30265.01	;
FBS	Invitrogen	16000-069
0,5% de tripsina / EDTA	Cellgro	25-053-Cl
Media MesenCult completa	Madre Cell Technologies	05511
0,4% w / v solución de tinción Giemsa	Sigma	GS1L
Paraformaldehído al 4%	Electron Microscopy Servicios	15710	16% paraformeldehyde se diluye al 4% con PBS
Carboxifluoresceína succinimidil ester (CFSE)	Sigma	21888