Registro yuxtacelular y tinción para un mapeo preciso de la actividad neuronal en una rata despierta

Resumen

Fuente: Moore, J. D., et al. Monitoreo yuxtacelular y localización de neuronas individuales dentro de las estructuras cerebrales subcorticales de ratas alertas, con la cabeza restringida. J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra el método de registro y tinción yuxtacelular en una rata despierta y restringida. El procedimiento consiste en registrar las señales de las neuronas e inyectar un tinte para localizar con precisión el sitio de grabación. Esta técnica permite un mapeo preciso de la actividad neuronal con la estructura anatómica del cerebro.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Monitorización yuxtacelular de unidades neuronales

1. Tire de un tubo capilar de cuarzo en un extractor de micropipetas láser de dióxido de carbono (consulte la sección Materiales) con diámetros de punta de menos de 1 μm (Figura 2A).
   NOTA: Los parámetros de calentamiento variarán según el instrumento en particular, y que el diámetro del cuello requerido variará según la estructura cerebral de interés. Para las grabaciones en tálamo de rata, las micropipetas tienen cuellos que oscilan entre 5 y 7 mm.
2. Asegure la pipeta en su lugar bajo un microscopio de contraste de interferencia diferencial (DIC) equipado con objetivos de larga distancia de trabajo. Utilice arcilla para modelar para mantener la pipeta en su lugar en la platina del microscopio.
3. Mueva lentamente un bloque de vidrio (de 0,5 a 1 cm de grosor; es conveniente un trozo de vidrio utilizado para hacer cuchillos ultramicrotomo) en el campo de visión con la punta de la pipeta. Con el micromanipulador de etapa, toque suavemente la punta de la pipeta con el vidrio, lo que hace que se rompa. Repita según sea necesario hasta que el diámetro exterior de la punta de la pipeta esté entre 1 y 3 μm (Figura 2B, C). Asegúrese de que estas micropipetas tengan impedancias entre aproximadamente 5 y 15 MΩ.
4. Prepare solución salina extracelular (135 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl₂, 1 mM de MgCl₂, 5 mM de HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico), pH 7,2 con NaOH) y agregue 2% (p/v) de Chicago Sky Blue. Llene el extremo posterior de la pipeta con la solución utilizando una jeringa con una aguja de 30 G o más pequeña. Alternativamente, para el marcaje yuxtacelular de una sola célula, agregue un 2% (p/v) de neurobiotina o amina de dextrano biotinilada (BDA-3000 o BDA-10000) a la solución salina en lugar de Chicago Sky Blue.
5. Coloque la rata dentro del calcetín de tela dentro del tubo rígido en una plantilla experimental apropiada (Figura 1). Espere un mínimo de 72 horas después de la cirugía antes de colocar al animal en la plantilla del reposacabezas. Apriete el cordón alrededor de la parte superior del esternón, en lugar del cuello, para evitar la obstrucción de las vías respiratorias. Si la respiración parece ser dificultosa u obstruida, afloje el cordón o muévalo hacia atrás. Lleve a cabo este procedimiento mientras la rata está alerta.
6. Fije la placa de sujeción de la cabeza en la rata a la pieza correspondiente en la plantilla. Para hacer esto, primero coloque la placa del reposacabezas en su lugar y luego asegúrela con un tornillo 4-40. Asegúrese de esperar hasta que el animal esté tranquilo para evitar aplicar un torque excesivo a la cabeza. A continuación, coloque una tuerca 8-32 en el perno de restricción de cabeza que está implantado en la rata. A continuación, atornille una varilla roscada de acero inoxidable al perno de cabeza. Fije la varilla a la plantilla experimental de tal manera que se pueda apretar en su lugar (Figura 1).
   NOTA: Asegurar al animal con el perno de la cabeza, así como con la placa del reposacabezas, minimiza la flexión del aparato y mejora la estabilidad del registro. En la mayoría de los casos, el registro puede comenzar el primer día que el animal está sujetado a la cabeza. Sin embargo, si el animal se inquieta excesivamente o vocaliza, proporciónele un día de entrenamiento para habituar el reposacabezas antes de comenzar cualquier grabación. En este caso, deje al animal en la plantilla durante 15 minutos y luego vuelva a colocarlo en su jaula. Repita este paso al día siguiente y continúe con el protocolo.
7. Abra la cámara de grabación y retire el gel de silicona. Si el tejido ha vuelto a crecer en la craneotomía, límpielo con pinzas finas.
8. Conecte la pipeta al micromanipulador motorizado y conecte el preamplificador de la etapa principal.
   NOTA: En la presente demostración, un pequeño circuito de relé en la etapa principal cambia entre los cables conductores del amplificador y una fuente de corriente externa con alta conformidad (Figura 3A-C). Tenga en cuenta que algunos amplificadores tienen una fuente de alta conformidad incorporada adecuada.
9. Utilice el micromanipulador motorizado para mover la punta de la pipeta hasta la marca identificada estereotáxicamente en la cámara de grabación. Anote las coordenadas de esta ubicación. Tenga cuidado de no romper la punta de la pipeta en el cráneo.
10. Mueva la pipeta al lugar de registro deseado en los ejes antero-posterior y mediolateral. A continuación, avance la pipeta ventralmente a través de la duramadre hasta que esté aproximadamente a 500 μm dorsal hasta el lugar de grabación previsto.
11. Avance lentamente la pipeta mientras escucha los eventos de pico en un monitor de audio del voltaje amplificado registrado entre la punta de la pipeta y el cable de referencia. Una vez que se identifiquen los eventos de pico, continúe moviendo la pipeta de 0 a 100 μm hasta que se observen desviaciones de voltaje positivo superiores a aproximadamente 500 μV.
    NOTA: La resistencia del electrodo aumentará en un factor de aproximadamente 1.5-10 cuando esto ocurra.
12. El registro debe comenzar una vez que se ha aislado una unidad, junto con todas las demás medidas conductuales y fisiológicas de interés. En la presente demostración, los movimientos de vibrisa autogenerados se monitorean con videografía de alta velocidad (ver sección de Materiales).
13. Para etiquetar el sitio de grabación, cambie los cables de los electrodos para que se conecten a la fuente de corriente. Hay varias formas de hacer esto, utilizando un circuito de relé (Figura 3A-C), una fuente de corriente incorporada en el amplificador o manualmente (Figura 3D). Pase -4 μA con pulsos de 2 segundos al 50 % del ciclo de trabajo durante 4 minutos para inyectar iontoforéticamente Chicago Sky Blue a través de la pipeta.
14. Matar y perfundir al animal después de varios procedimientos de etiquetado de acuerdo con la práctica estándar. Seccione el cerebro y la contratinción según sea necesario para identificar la ubicación anatómica del sitio de registro. Contratinción del tejido para la reactividad de la citocromo oxidasa. Alternativamente, identifique los depósitos de Chicago Sky Blue utilizando microscopía de fluorescencia.
    NOTA: Para diferenciar con precisión entre las diferentes unidades marcadas, es importante que todas las etiquetas se hagan con la misma pipeta el mismo día, sin desabrochar la pipeta entre etiquetas. En este caso, los sitios de registro se pueden diferenciar por sus ubicaciones relativas en la histología post-hoc, junto con las coordenadas del manipulador anotadas de cada sitio. Para una identificación inequívoca, marque las etiquetas a una distancia mínima de 200 μm entre sí, y no más de 3-5 etiquetas por región del cerebro.

Resultados

Figura 1: Plantilla experimental. Diagrama de rata en la plantilla mecánica para experimentos electrofisiológicos y de monitorización del comportamiento. La plantilla utiliza la barra y la placa

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ketaset (Ketamine HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (solución de xilacina)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidona Yodada)	CVS Pharmacy	269281
Loctite 495	Grainger Industrial Supply	4KL86	20-40 cp cianoacrilato
Vetbond	3M	1469SB
Grip cemento en polvo	Dentsply Intl	675571	Para la base de la cámara de grabación
Agarre cemento líquido	Dentsply Intl	675572	Para la base de la cámara de grabación
Gel de silicona	Dow Corning	Mar-80
Polvo acrílico de reparación de dentaduras postizas a chorro	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	Para asegurar el aparato de reposacabezas al cráneo
Ortho-Jet Resina acrílica ortodóntica de curado rápido líquido	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	Para la fijación del aparato de reposacabezas al cráneo
Chicago azul cielo	Sigma	C8679
Paraformaldehído	Sigma	158127	Para la perfusión y la fijación de tejidos
Solución salina tamponada con fosfato	Sigma	P3813	Para perfusión y fijación de tejidos
Citocromo C	Sigma	C2506
Diaminobencidina	Sigma	D5905
Calcetín de rata	Cosido elegante (San Diego, CA)	N/A
Tubo de PVC 2 1/2"	U.S. Plastic Co.	34108
Pines y zócalos D subminiatura	TE Connectivity	205089-1
acero inoxidable de 0.010" de diámetro	Precision Brand Products, Inc.	21010
Bastidor de sujeción estereotáxico	Kopf Instruments	Modelo 900
Barras estereotáxicas	Kopf Instruments	Modelo 957
Manipulador estereotáxico	Kopf Instruments	Modelo 960
1/2 mm	fresa Henry Schein	100-3995
Quiet-Air taladro dental	Midwest Dental	393-1600
Tornillo de acero inoxidable 0-80 1/8"	Sujetador superstore	247438
tubo de centrífuga de 0,2 ml	Fisher Scientific	05-407-8A
Barra de sujeción de cabeza personalizada	UCSD SIO Machine Shop	N/A Abrazadera
de poste en ángulo recto	Newport	MCA-1
8-32 3/4" tornillo	Sujetador Superstore	240181
4-40 Tornillo de 1/4"	Sujetador Superstore	239958
Tubo capilar de cuarzo	Sutter Instruments	QF-100-60-10
Micromanipulador motorizado	Sutter Instruments	MP-285
Amplificador de microelectrodos	Molecular Devices	Multiclamp 700B	Parte alternativa: Molecular Devices Axoclamp 900A
Etapa de cabeza del amplificador de microelectrodo	Molecular Devices	CV-7B	Parte alternativa: HS-9Ax10 con Molecular Devices Axoclamp 900A
Estimulador de pulsos aislado	A-M Systems	Modelo 2100	Parte alternativa: HS-9Ax10 con Molecular Devices Axoclamp 900A
Monitor de audio	Radio Shack	32-2040
Alambre conductor del electrodo	Alambre Cooner	NEF34-1646
Relé para la etapa de la cabeza del amplificador	Tecnología COTO	#2342-05-000	(opcional) Utilizado con una placa de circuito impreso hecha a medida (UCSD Physics Electronics Shop), Figura 6A-C
Cámara de video digital	Basler	A602fm
Soporte de pipeta	Warner Instruments	#MEW-F10T
Placa de sujeción de cabezal personalizada	UCSD SIO Machine Shop N	/A

Alambre musical de