La metilación del ADN: Bisulfito de modificación y análisis

Summary

El estándar de oro para el análisis de metilación del ADN es la secuencia del genoma de ADN de bisulfito de convertir. Este método tiene la ventaja de la mayor sensibilidad de la citosina en comparación con el 5-metilcitosina (5-MEC) de bisulfito de desaminación en condiciones ácidas. Citosinas no metiladas se puede distinguir de citosinas metiladas después de la amplificación por PCR del DNA genómico de destino.

Abstract

La epigenética se describen los cambios heredables en la función génica que se producen independientemente de la secuencia de ADN. Las bases moleculares de la regulación epigenética de los genes es complejo, pero esencialmente implica modificaciones en el propio ADN o las proteínas con las que se asocia el ADN. La modificación epigenética del ADN predominante en los genomas de los mamíferos es la metilación de los nucleótidos citosina (5-MEC). Metilación del ADN proporciona instrucciones a la maquinaria de expresión genética en cuanto a donde y cuando el gen debe expresarse. La secuencia de prioridad para la metilación del ADN en los mamíferos es el 5'-CpG-3 'dinucleótidos (Figura 1). Dinucleótidos CpG no están distribuidos uniformemente a lo largo del genoma, pero se concentran en las regiones de las secuencias genómicas repetitivas y CpG "islas" comúnmente asociados con los promotores de genes (Figura 1). Los patrones de metilación del ADN se establecen temprano en el desarrollo, modulado durante la diferenciación de tejidos específicos e interrumpido en muchas enfermedades incluyendo el cáncer. A understand el papel biológico de la metilación del ADN y su papel en las enfermedades humanas, precisa, eficiente y reproducible métodos son necesarios para detectar y cuantificar cada cinco-MEC.

Este protocolo para la conversión de bisulfito es el "gold standard" para el análisis de metilación del ADN y facilita la identificación y cuantificación de la metilación del ADN en la resolución de un solo nucleótido. La química de la desaminación de citosina por bisulfito de sodio en tres etapas (Figura 2). (1) sulfonación: La adición de bisulfito al enlace doble 5-6 de la citosina (2) La desaminación hidráulica: desaminación hidrolítica de las resultantes citosina-bisulfito de derivados para dar un derivado de uracilo-bisulfito (3) Desulphonation álcali: La eliminación de la sulfonato grupo por un tratamiento alcalino, para dar el uracilo. Bisulfito de preferencia desamina citosina a uracilo en el ADN de cadena sencilla, mientras que cinco-MEC, es refractaria a bisulfito mediada por desaminación. Tras la amplificación por PCR, el uracilo se amplificacomo timina mientras que el 5-MEC residuos permanecen como citosinas, lo que permite metilado CpGs deben distinguirse de los CpGs metilado por la presencia de una citosina "C" frente a la timina "T" de residuos durante la secuencia.

Modificación del ADN mediante la conversión de bisulfito es un protocolo bien establecido que puede ser explotado para muchos métodos de análisis de metilación del ADN. Desde la detección de 5-MEC por la conversión de bisulfito se demostró por primera vez por Frommer et al. ¹ y Clark et al. ^2, en torno a los métodos de conversión de bisulfito de la cuenta de ADN genómico para la mayoría de los nuevos datos sobre la metilación del ADN. Diferentes métodos de análisis post PCR puede ser utilizada, en función del grado de especificidad y la resolución de la metilación del necesario. La clonación y secuenciación sigue siendo el método más fácil acceso que puede dar solución de un solo nucleótido para la metilación a través de la molécula de ADN.

Protocol

Bisulfito de conversión de protocolo

Un protocolo estándar para la conversión de 2 mg de ADN genómico se describe a continuación. Cantidades más pequeñas o más grandes de ADN genómico (100 pg-200 mg) puede también ser tratado con éxito de bisulfito. Estas condiciones de reacción como resultado una conversión completa (99,5 a 99,7%) de casi todas las secuencias de ADN objetivo del ^3.

1. Preparación de ADN

Preparación de muestras mediante la incubación de ADN genómico con bisulfito de buffer de lisis de ADN (2 ug de ARN t, 280 ng / l de proteinasa K, 1% SDS) en un volumen total de 18 l durante 1 hora a 37 ° C. Nota: Esto es importante para lograr conversión de bisulfito de máxima, especialmente con el ADN aislado de muestras clínicas, donde todavía puede haber proteína asociada con el ADN.

2. Desnaturalización del ADN

1. Desnaturalizar 2 mg de ADN en un volumen de 20 l mediante la adición de 2 l de recién preparada 3M NaOH a una final de concentration de 0,3.
2. Incubar las muestras a 37 ° C durante 15 minutos en un baño de agua, seguido de incubación a 90 ° C durante 2 minutos en un bloque de calor. Inmediatamente se colocan los tubos en hielo durante 5 min.
3. Centrifugar los tubos a 4 º C durante 10 s de 10.000 g, para asegurar que el ADN se encuentra en la parte inferior del tubo.

3. La desaminación de bisulfito

Sulfonación y desaminación hidrolítica

1. Prepare nuevas soluciones de 10 mM de sodio y grasas saturadas Quinol pH 5,0 metabisulfito (7,6 g de Na ₂ S ₂ O _5, con 464 l de 10 M NaOH, de hasta 15 ml con agua). La solución de bisulfito de sodio saturado se logra invirtiendo suavemente el reactivo / H ₂ O mezcla, con la mezcla mínima y la aireación. Si es necesario, ajustar el pH con NaOH 10 M, para la disolución completa de la Nota de metabisulfito:. Como se trata de una solución saturada, pequeños bultos todavía no se han disuelto.
2. Añadir 208l de la metabisulfito saturada y 12 l de 10 mM Quinol al ADN desnaturalizado (20 l), en un volumen final de 240 l con una concentración final de 2.31M bisulphite/0.5mM Quinol, pH 5,0. Mezclar suavemente todos los reactivos y centrifugar durante 10 segundos para asegurar todas las gotitas están en el fondo del tubo.
3. Superposición de las muestras con 200 l de aceite mineral. Incubar las muestras a 55 ° C en un baño de agua, de 4.16 hrs. La duración del tratamiento bisulfito depende de la cantidad y la calidad del ADN que se va a convertir. Para el ADN de mala calidad o ADN degradado, limitar el tiempo de incubación de 4 horas. Nota: es importante que los que la conversión de bisulfito se lleva a cabo en la oscuridad para evitar la oxidación, por lo que si que no es posible envolver los tubos en papel de aluminio antes de la incubación .
4. Al final del tiempo de incubación adecuado, girar los tubos brevemente en un microcentrífuga para asegurar que todo el líquido se encuentra en la parte inferior del tubo.
5. Recuperar el ADN de bisulfito de tratadospor debajo de la capa de aceite con cuidado pipeteando la solución de ADN de la parte inferior del tubo, sin ocupar ninguno de los aceites minerales.

Desalación

5. Eliminar cualquier iones bisulfito libre al pasar a través de una columna de la desalación y eluyendo en 50 l de agua milli-Q (MQH ₂ O). Dependiendo de la cantidad y la calidad del ADN genómico y cómo se prepara, distintas columnas de la desalación se puede utilizar. Nosotros usamos Promega Asistente para limpieza de columnas, ya que estas columnas son adecuados para eliminar el SDS utilizados en la preparación del ADN antes de la conversión.

Desulphonation álcali

6. El aducto de bisulfito se retira el anillo de uracilo por desulphonation. Desulphonate mediante la adición de 5,5 l de recién preparada 3M NaOH a una concentración final de 0,3 M, luego incubar las muestras a 37 ° C durante 15 min.
7. Centrifugar brevemente y agregar 1 l de ARN t (10 mg / ml).
8. Neutralizar la solución con la adición de 33 l de acetato de amonio (NH ₄ Ac O), pH 7,0 a una concentración final de 3M.
9. Etanol precipitar el ADN mediante la adición de 330 l de helado 100% de etanol, mezclar bien por inversión. Dejar en-20μC durante 1 hora o toda la noche. Centrifugar a 14.000 g durante 15 min a 4 ° C. Eliminar todos los rastros de sobrenadante y secar al aire el ADN se precipitó a ~ 20 min.
10. Vuelva a suspender el pellet de ADN en 50 l / g de 0,1 O. TE (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) o H ₂ Dejar a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas. De vez en cuando los tubos de vórtice para asegurar que el ADN se disuelve, seguido por una centrifugadora rápida.
11. Uso inmediato para la amplificación de PCR, o almacenar a -20 ° C durante 10-10 años, dependiendo de la cantidad y la calidad del ADN.

4. Amplificación

Primer diseño

1. Diseño efectivo de PCR bisulfito de conversión de los primers específicos es crucial para asegurar que la amplificación eficiente e imparcial de ADN completamente convertido ocurre. Las siguientes pautas se utilizan para ayudar al diseño de imprimación.

Directrices diseño de la cartilla

Thermocyling

2. Para la prueba de amplificación de PCR proporcional de ADN metilado y no metilado, use un metilados 50:50 / Unmethylated totalmente bisulfito de la muestra de control convierten y amplifican con el bisulfito de conversión de cebadores específicos de las condiciones de reacción optimizadas PCR (Figura 3). Para el 50:50 metilados: Unmethylated control, el uso in vitro de ADN metilado y LICE ya sea de todo el genoma amplificado (WGA) de ADN o de ADN de sangre total. Tenga en cuenta que algunos genes se metila naturalmente en la sangre y por lo tanto, en estos casos lo mejor es usar sólo WGA ADN como el "Unmethylated" de control.
3. Prepare las mezclas de amplificación de PCR en 100 & mu; alícuotas l que contiene 2 l de bisulfito de ADN genómico convertidos, 200 mM dNTP, cebadores 1 M, 1,5 mM de _MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3 y 0,15 l de Taq polimerasa.
4. En un termociclador de gradiente de temperatura, ajuste la reacción se ejecutan en un gradiente de + / - 3 ° C en la predicción de Tm de la cartilla a través de 10 tubos

5. Para probar que los amplicones metilado y no metilado se han ampliado en proporción, la amplificación puede ser digerido con una enzima de restricción informativa, como Taq 1 (TCGA), que va a digerir ADN metilado, pero no va a digerir ADN no metilado en el sitio de la enzima de restricción es alterada después de la conversión de bisulfito de TTGA. La extensión de la digestión puede ser visualizado por electroforesis en gel de agarosa (Figura 3). Por otra parte, SYBRGreen (0,2 l de dilución 1:1000) se puede agregar a la reacción de PCR yel grado de metilación puede ser evaluado mediante la realización de las parcelas de calor de disociación en un termociclador en tiempo real PCR (Figura 3B).
6. Mezcla de reacción PCR incluyendo _MgCl2 condiciones de concentración y termociclado posible que tenga que ser ajustada para aumentar la eficiencia de la PCR o para asegurar una amplificación proporcional PCR de los fragmentos de PCR desnaturalizado y no metilado.
7. Una vez que las condiciones de PCR han sido optimizados, la amplificación por PCR se puede realizar en muestras de bisulfito convertidos. Nota: Una vez que la Tm se ha optimizado un gradiente de temperatura PCR no es necesario usar.

5. Los resultados representativos:

Un ejemplo de optimización de bisulfito de amplificación por PCR se muestra en la Figura 3. Condiciones óptimas de amplificación por PCR se amplifican amplicones metilados y no metilados en proporción y sin prejuicios. La figura 3A muestra un gel de agarosa con un perfil de gradiente de temperatura amplificación por PCR a partir de una mezcla de ADN metilado 50% y no metilado. ªe amplicones de la PCR se han tratado con una enzima de restricción Taq 1 (TCGA), que se digieren metilada (M) de ADN, pero no va a digerir no metilados (U) de ADN, como el sitio de la enzima de restricción se ve alterada por la conversión de bisulfito de TTGA. Una cantidad igual de cortar y cortar producto de PCR se espera si el ADN metilado y no metilado se amplifica en proporción. Se puede ver en este gel que las condiciones óptimas para thermocyling no sesgo de amplificación es de 56,1 ° C (T). Conversión completa del ADN de bisulfito también pueden ser analizados por la digestión con la enzima citosina-sitio específico, como Hpa III (CCGG). Hpa III sólo digerir si la conversión ha fallado, como el sitio de restricción se mantendrá. Si la conversión se ha completado el sitio de restricción se convierte en TCGG o TTGG dependiendo del estado de metilación del ADN. Conversión completa de ADN de bisulfito se puede ver en la figura 3A (H).

Figura 3B muestra una gráfica de tiempo real que la disociaciónTambién se puede utilizar como una herramienta para determinar si existe algún sesgo de amplificación basada en la temperatura a la que las diferentes moléculas se disocian. En esta figura se puede observar que el PCR ha amplificado desnaturalizado (M) y el ADN metilado (U) en proporción de una mezcla de ADN de 50% metilado y unmethylated en comparación con la amplificación de ADN de control totalmente metilado y unmethylated que se disocian en 82.1μC y 78.9μC respectivamente.

Después de la optimización de las condiciones de reacción y thermocyling bisulfito muestras tratadas pueden ser amplificados con primers específicos capítulo específico y bisulfito, ya sea en una sola reacción anidada o semi-PCR. El resultado de fragmentos de PCR puede ser visualizado por electroforesis en gel de agarosa y se secuencia, ya sea directamente (Figura 4) o por la clonación y secuenciación. Después de la clonación y la secuenciación del estado de metilación de las moléculas individuales pueden ser identificados con claridad en un mapa de bisulfito (Figura 4B), para visualizar la heterogeneidad demetilación.

Análisis de alto rendimiento cuantitativo de metilación puede ser preformado uso de la tecnología, como la utilizada por el método EpiTYPER Sequenom. El uso de este método, el ADN se amplifica bisulfito convertido con bisulfito de cebadores específicos de PCR y seguido por un proceso de división proprietry. Los fragmentos resultantes se cuantifican por espectrometría de masas MALDI-TOF con el espectro específico depende de la presencia de citosinas metiladas (Figura 5). Un resumen de los ratios de metilación en la muestra puede ser extrapolado en forma de un epigrama (Figura 5) o la trama de metilación (Figura 5).

Figura 1. Esquemática CpG metiladas. En la célula normal, el promotor asociado a las islas CpG son en su mayoría no metilados (gris), mientras que los sitios CpG en los órganos de genes son escasos y, en general metilado (rojo). El panel de la derecha se expande la estructura molecularUre de ADN en un sitio CpG individuales y muestra la metilación con una molécula de CH3 en el carbono 5 de citosina.

Figura 2. . Químicos esquema de conversión de Análisis de la metilación del ADN consta de cuatro etapas principales que se muestra, la desnaturalización, la conversión de bisulfito, amplificación por PCR y análisis. En el panel derecho, las modificaciones de la molécula de citosina que se producen durante la conversión de bisulfito se muestran.

Figura 3. La optimización de la amplificación por PCR. A. Agarosa por electroforesis en gel con un perfil de gradiente de temperatura amplificación por PCR a partir de una mezcla de ADN metilado 50% y no metilado. Los fragmentos se han digerido con Taq1 (T) o HpaIII (H) que digieren el ADN metilado y no el ADN de bisulfito convertidos respectivamente. B. Calor análisis de la curva de disociación muestra una ecuaciónl porcentaje de ADN metilado y no metilado (línea roja mezcla 50/50) en comparación con el control de amplificación completamente metilado (línea rosa, M) y el ADN metilado (línea verde, U), que se disocian en 82,1 ° C y 78,9 ° C respectivamente.

Figura 4. Ejemplo de secuenciación directa y un mapa de bisulfito. A. Secuencia de traza a partir de tres líneas celulares diferentes con los sitios CpG resaltado en amarillo. La línea celular de X muestra el 100% de metilación en los tres sitios CpG, mientras que las líneas celulares Y y Z muestran distintos grados de metilación como se ve por la superposición de G / A las señales. B. Representante de bisulfito de mapa que muestra la densidad de metilación (puntos rojos) en los respectivos sitios CpG, según lo determinado por secuenciación directa de los distintos clones.

Figura 5. ADN de alto rendimiento con el análisis de metilación Sequenom. A. Espectro de vista utilizando la tecnología Sequenom epiTYPER. Fragmentos de ADN mostrar espectros específicos, dependiendo de la cantidad presente de la metilación del ADN. B. Epigrama resumen del porcentaje de metilación del ADN en cada sitio CpG de cuatro líneas diferentes de células. La metilación C. resumen de la trama derivada de la Epigrama Sequenom.

Discussion

El análisis de metilación del ADN mediante la secuenciación del genoma de ADN de bisulfito convertido es un método bien establecido y versátil que facilita la identificación y cuantificación de la metilación del ADN en la resolución de un solo nucleótido. Sin embargo, la conversión de bisulfito y posterior análisis se basa en la premisa de que el ADN ha sido completamente renovado con cada citosina no metilados se desaminada a uracilo y sólo citosinas metiladas restantes no-reactiva. Si la conversión es incompleta, pueden surgir problemas con el análisis ya que no convertidos citosinas no metiladas puede ser interpretado erróneamente como citosinas metiladas. Bisulfito de conversión puede ser optimizado en varias etapas para maximizar el porcentaje de conversión. De ADN para convertirse completamente en primer lugar, debe ser una sola cadena para que los residuos de citosina están expuestos a los iones bisulfito. El primer paso, la desnaturalización del ADN, es crítica y puede ser el origen de la conversión incompleta si el ADN no está totalmente desnaturalizado. A fin de garantizarque el ADN está completamente desnaturalizado es importante que los parámetros de reacción incluyendo la eliminación de todas las proteínas asociadas, la concentración de sal adecuado, la temperatura de incubación y el tiempo son adecuadas para mantener el ADN en la conformación de cadena sencilla. Es importante la utilización de nuevas NaOH 3M y para permitir que el tiempo de incubación adecuado. Si el ADN se resiste a la desnaturalización, algunas modificaciones en el protocolo, incluidos la ampliación del tiempo de incubación a 30 minutos o la fragmentación del ADN antes de la desnaturalización puede facilitar la desnaturalización del ADN. Además, el ADN de cadena sencilla (ssDNA) puede volver a recocer a ADN de doble cadena (dsDNA) durante la reacción de conversión de bisulfito. Llevar a cabo la reacción a una temperatura más alta (90-95 ° C) de manera periódica o continua durante la reacción de bisulfito puede ayudar al mantenimiento de ssDNA. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la degradación del ADN se acelera enormemente a estas temperaturas altas. Varios reactivos también se pueden añadir a interrumpir re-recocido de the hebras de ADN, como la urea.

La concentración de ADN y su calidad también puede afectar la eficiencia de la reacción de bisulfito y última producción de PCR. La degradación del ADN es una limitación de la conversión de protocolos de bisulfito. El tratamiento químico del ADN presenta varios picos en la cadena de ADN de cadena simple y algunas de las duras condiciones necesarias para la conversión completa de bisulfito incluyendo la concentración de bisulfito de alto, largos tiempos de incubación puede acelerar la degradación del ADN. Bajo las condiciones de reacción estándar descrito, la degradación del ADN no es un problema común, sin embargo, si las modificaciones del protocolo se introducen, por ejemplo, para las secuencias que son refractarios a la conversión, para las plantillas de ADN que se degradan o de mala calidad, tales como muestras de FFPE, entonces la degradación del ADN puede convertirse en una limitación importante.

Formol e incluidos en parafina fijo, (FFPE) y muestras de ADN degradado puede ser efectivamente bisulfito de convertir y amplificado utilizando este protocoloSin embargo, las modificaciones para asegurar que el ADN no se degrada aún más se recomienda. El uso de un carrier RNA como t ARN se recomienda. También el glucógeno se puede agregar como un portador cuando la concentración de ADN es baja (<200 ng). Dado que el ADN aislado de los tejidos FFPE ya está fragmentado y una mayor fragmentación lleva a cabo durante la desaminación, se debe tener cuidado para minimizar la degradación. No los fragmentos de ADN más lejos antes de la desnaturalización y limitar el tiempo de incubación de la reacción de bisulfito de 4 horas. Diseño amplicones no mayor de 300 pb, debido a ADN fragmentado.

Otro factor que puede afectar a la amplificación por PCR que la conversión de bisulfito de citosinas no metiladas reduce la complejidad de la plantilla de ADN. El protocolo de diseño de la cartilla siguiente se describe en la sección 4.1, una mayor duración de imprimación y PCR, pueden ayudar a aumentar la especificidad y el rendimiento de la PCR.

Por último, desde la plantilla de ADN se altera durante bisulphite de conversión, el sesgo de amplificación puede ser una preocupación. Asegúrese de que proporcional de la amplificación por PCR de plantillas metilado y no metilado se comprueba con un control de 50/50 M / U mezcla de ADN, como se indica en el protocolo, vea la Figura 3. Asegúrese también de que la amplificación de las plantillas sólo se convierten está ocurriendo utilizando la enzima de restricción HpaIII y electroforesis en gel (Figura 3). Las condiciones de PCR puede ser necesario optimizar variando la concentración de la temperatura y / o magnesio o alargar el tiempo de prórroga. Algunas plantillas parecen ser particularmente problemático y la posición de imprimación puede ser necesario ajustar o degenerados posible que tenga que ser utilizado.

Próxima generación de técnicas de secuenciación están evolucionando rápidamente para conseguir una resolución similar a la secuencia genómica de bisulfito, y la secuencia de la tercera generación de una sola molécula tiene el potencial de permitir un análisis tanto de primaria del ADN y la metilación, sin la necesidad de que la secuenciación de bisulfito. Sin embargo, la amplia disponibilidad y especificacionesificity de estas técnicas siguen siendo un tiempo lejos. La secuenciación genómica de bisulfito es el estándar de oro en el análisis de metilación y es un protocolo robusto. El método ha progresado hasta el punto en el que los problemas comunes y las limitaciones han sido resueltos y las aplicaciones se han ampliado a partir de análisis de genes individuales de alto rendimiento y el análisis del genoma completo descrito por Clark et al. ⁴ 2006. Instrucciones para resolver problemas y recomendaciones adicionales se describen en la Tabla 1. Se sugiere que el enfoque óptimo es seguir inicialmente el protocolo estándar y sólo introduce modificaciones siempre y cuando surge un problema.

Tabla 1. Instrucciones para resolver problemas

Materials