Administración intranasal de células madre mesenquimales en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Etiquetado de células madre mesenquimales (MSC) con nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPIO)

1. Para etiquetar MSC con SPIO, agregue 6 ml de medios de etiquetado (25 μg / ml de SPIO en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco sin suero fetal bovino (FBS)) a un matraz T75 que contenga MSC (80% de confluencia).
2. Incube las células con el medio de marcado en una incubadora de CO₂ (37 °C, 5% CO₂ ) sin agitar. Después de 24 h, retire suavemente el medio de etiquetado con una pipeta Pasteur estéril con una punta de plástico conectada al vacío. Lave las células monocapa 2 veces con 6 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar cualquier rastro de SPIO no internalizado.
   1. Para determinar si las células se han marcado con éxito, verifique las células marcadas bajo un microscopio fluorescente o un microscopio confocal si el SPIO está marcado con un fluoróforo (es decir, como los que se usan aquí; Figura 1B, C).
3. Recolectar las células adherentes mediante tratamiento con 3 ml de tripsina e incubar a 37 °C. Después de 5 min de incubación, agregue 7 ml de medio DMEM precalentado con 10% de FBS (v / v) para inactivar la tripsina. Recoja la suspensión celular con una pipeta en un tubo cónico de 15 ml.
4. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min. Desechar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular en PBS. Cuente las células viables con colorante azul de tripano y un hemocitómetro.
   NOTA: El sedimento celular de las células marcadas aparecerá como un color oscuro debido a la carga de hierro (Figura 1D). Este protocolo es relevante para el etiquetado de MSC y la resonancia magnética (RM). El procedimiento para el etiquetado de MSC se ha optimizado previamente, y aquí solo se incluyen los pasos para preparar las MSC etiquetadas para realizar un seguimiento in vivo, ya que el seguimiento in vivo es el enfoque. El protocolo para el cultivo y el etiquetado de otros tipos de células debe ser optimizado por el investigador.
5. Ajuste la concentración celular usando PBS a 150,000 células (o un número que resulte en una señal de resonancia magnética suficiente) en 18 μL de PBS (o el volumen total que se utilizará en el procedimiento de administración intranasal).
   NOTA: Se observó que una concentración celular superior a 150,000 células/18 μL de PBS conduce a la agregación celular, lo que puede afectar la eficiencia de la administración intranasal. Si se necesita un mayor número de células para la administración intranasal, aumente el volumen total de suspensión celular y aumente el número de administraciones intranasales, ya que la administración intranasal es un procedimiento no invasivo y es posible la administración de dosis múltiples.

2. Lesión por impacto cortical controlado (CCI)

NOTA: En este protocolo, los ratones machos C57 BL / 6 (7-8 semanas de edad) se mantuvieron en un ciclo de luz / oscuridad de 12/12 h con acceso ad libitum a alimentos y agua.

1. Para preparar a cada ratón para la lesión de CCI, administre el cóctel anestésico de zolazepam (50 mg / kg) y xilacina (20 mg / kg) mediante inyección intraperitoneal (i.p.) (1 ml / kg). Asegúrese de que la profundidad de la anestesia sea suficiente por falta de respuesta de pellizco en el dedo del pie. Alternativamente, coloque el ratón en una cámara suministrada con isoflurano al 2% al 4% durante 60 s.
2. Afeite el pelaje de la superficie dorsal del cráneo entre las orejas con una cortadora de cabello electrónica. Limpie el área afeitada varias veces con un hisopo de algodón estéril empapado en yodo. Use un hisopo de algodón empapado en etanol al 70% para limpiar el yodo.
3. Coloque el ratón anestesiado en el marco estereotáctico y asegure el ratón con barras para los oídos y la nariz. Realice una incisión sagital media (aproximadamente 2,5 cm) en la piel afeitada con unas tijeras estériles para acceder a la superficie del cráneo.
4. Retire el tejido del hueso con una almohadilla de algodón para exponer el cráneo. Limpie la superficie del cráneo con un hisopo de algodón empapado en peróxido de hidrógeno al 3% (H₂O₂) durante 10 s, luego límpielo con un algodón seco.
   NOTA: Las suturas del cráneo y tanto el bregma como el lambda ahora se pueden identificar fácilmente.
5. Identifique las coordenadas de elección en la superficie del cráneo para la lesión de CCI y dibuje un círculo (4 mm de diámetro) alrededor de las coordenadas con un lápiz o marcador adecuado.
   NOTA: En este protocolo, las coordenadas anteroposterior (AP) -2,0 mm y mediolateral (ML) +1,5 mm se utilizaron para la inducción de CCI.
6. Usa un microtaladro y una fresa redonda (0,5 mm de diámetro) para adelgazar el cráneo en el círculo marcado. Evite aplicar presión mientras perfora, ya que perforar el hueso puede dañar el parénquima cerebral. Limpie el polvo de huesos con un hisopo de algodón limpio y seco.
7. Retire suavemente el colgajo óseo con pinzas finas estériles para exponer la duramadre mientras la mantiene intacta. Retire el mouse del marco estereotáctico que se utilizó para la preparación previa a la lesión y colóquelo en el marco estereotáctico del dispositivo CCI.
8. Estabilice la cabeza del ratón con las barras para los oídos y las barras nasales. Asegúrese de que la cabeza del ratón esté nivelada en la dirección rostral-caudal y ajuste las barras nasales, si es necesario.
9. Siga las instrucciones de la caja de control para poner a cero la punta del impactador en la superficie cortical expuesta. Asegúrese de que la punta del impactador esté alineada directamente sobre las coordenadas de la corteza deseada para ser impactada usando las ruedas de control X e Y en la base del impactador.
10. Establezca los parámetros del experimento utilizando la caja de control con una velocidad de 5 m/s, un tiempo de permanencia de 250 ms y una profundidad de lesión de 1 mm para inducir una lesión leve en el ratón.
11. Induzca lesiones presionando el botón ''impacto'' en la caja de control. Limpie cualquier sangrado que ocurra con un hisopo de algodón estéril.
12. Retire el ratón del marco estereotáctico y cierre la incisión con suturas quirúrgicas de seda. No use clips de metal para cerrar el sitio quirúrgico, ya que el ratón será sometido a un campo magnético para la resonancia magnética.
13. Aplique antibióticos tópicos (bacitracina neomicina) en el sitio quirúrgico para prevenir infecciones. Mantenga el mouse en la almohadilla térmica y vigílelo de cerca durante la fase de recuperación.
14. Administre ketoprofeno (2,5 mg/kg, IP) diariamente durante 3 días después de la cirugía, a menos que la administración de ketoprofeno contradiga los objetivos del estudio.

3. Administración intranasal

1. 1 día después de la inducción de CCI, administre el cóctel anestésico de zolazepam (50 mg / kg) y xilacina (20 mg / kg) mediante inyección i.p. Asegúrese de que el ratón esté profundamente anestesiado por falta de respuesta de pellizco del dedo del pie.
2. Preparar al ratón para la administración intranasal de MSC mediante tratamiento con hialuronidasa.
   1. Agarra el cogote del ratón y gíralo de espaldas con firmeza mientras inmovilizas el cráneo. Coloque la punta de una pipeta que contenga hialuronidasa en PBS estéril (4 U/μL) cerca de la fosa nasal del ratón en un ángulo de 45°.
   2. Administrar 3 μL de suspensión de hialuronidasa en cada fosa nasal. Mantenga el mouse inmovilizado y mirando hacia arriba sobre una almohadilla limpia durante 5 minutos. Repita el tratamiento con hialuronidasa 4 veces (total de 100 U de suspensión de hialuronidasa).
3. Después del tratamiento con hialuronidasa, mantenga el ratón tratado sobre una almohadilla limpia hacia arriba durante 30 min.
4. Para administrar MSC en el cerebro, sostenga el mouse firmemente, como se describe en el paso 3.2.1. Administrar 3 μL/fosa nasal de suspensión de MSC con un intervalo de 3 s. Mantenga el mouse en la misma posición durante 30 s hasta que las gotas de muestra hayan desaparecido por completo.
   NOTA: Evite formar burbujas de aire durante la administración.
5. Repita la administración con un intervalo de 2 minutos de hasta 3x.
   NOTA: El número total de células que se administrarán es de 150.000, de modo que se pueden administrar 18 μL de la suspensión celular a una dosis de 3 μL para cada fosa nasal, 3x cada una.
6. Regrese al ratón a su jaula y vigílelo de cerca hasta que se recupere por completo de la anestesia.

Figura 1: Diagrama de flujo esquemático del protocolo y confirmación in vitro de la adopción de SPIO por parte de las MSC. (A) Las MSC se incubaron con SPIO durante 24 horas para su etiquetado. Luego, las MSC marcadas se administraron en un modelo de ratón TBI a través de una ruta intranasal (IN). Se realizó una resonancia magnética en diferentes puntos de tiempo para rastrear las MSC marcadas. La confirmación de un etiquetado suficiente de las MSC por SPIO se logró mediante (B) microscopía de fluorescencia y (C) microscopía confocal utilizando el canal FITC, ya que las nanopartículas de SPIO se marcaron con FITC. (D) El gránulo celular de las MSC marcadas apareció de color oscuro debido a la carga de hierro. FITC = isotiocianato de fluoresceína; SPIO = partículas superparamagnéticas de óxido de hierro; MSC = células madre mesenquimales; RM = resonancia magnética; IN = intranasal; TBI = lesión cerebral traumática.