Estimulación eléctrica transcraneal de la corteza motora en una rata despierta

Resumen

Fuente: Fritsch, B. et al. Estimulación Cerebral Eléctrica Transcraneal en Roedores Alerta. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra la implantación de electrodos y la aplicación de estimulación eléctrica transcraneal (tES) a la corteza motora de ratas alerta. Describe los pasos involucrados en la colocación de electrodos, la administración de estimulación y la activación neuronal y microglial resultante, destacando su potencial neuroterapéutico.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Procedimiento quirúrgico: Implantación de electrodo torácico

NOTA: Este paso se puede omitir cuando el contraelectrodo se coloca externamente en el pecho afeitado con un chaleco.

1. Coloque al roedor boca abajo (sobre el pecho) en la mesa de operaciones.
   NOTA: En caso de anestesia por inhalación, mantenga el hocico de la rata colocado en la boquilla de anestesia, reduciendo aún más la concentración de isoflurano al 1,5-2%.
2. Desinfecte el cuero cabelludo afeitado con un aerosol desinfectante o con un hisopo empapado en un agente antiséptico (por ejemplo, etanol al 70%) y déjelo secar al aire. Repita dos veces.
3. Corte la piel con un bisturí en una línea desde el nivel rostral del ojo hasta el nivel del oído medio.
   NOTA: Esto permite tunelizar el cable de conexión desde el electrodo torácico implantado hacia la parte superior de la cabeza y también es el corte deseado para la colocación del encaje del electrodo de estimulación de corriente continua (DCS).
4. Gire la rata a posición supina, de modo que el pecho quede expuesto.
5. Desinfecte la piel del tórax como se describe en el paso 1.2.
6. Eleve la piel lateral del pecho derecho con pinzas de tejido y corte un ojal con unas tijeras pequeñas de unos 0,5 cm medial desde la axila derecha. Luego, haga un corte sagital recto en orientación craneal con las tijeras.
7. Formar una bolsa subcutánea desconectando atraumáticamente la piel del músculo pectoral mayor izquierdo. Hágalo abriendo repetidamente las tijeras pequeñas (o con un hisopo de algodón empapado en solución salina).
8. Gire al animal sobre su lado derecho para hacer un túnel en el camino del cable desde la esquina occipital izquierda de la piel de la cabeza abierta a lo largo del cuello para salir a la bolsa pectoral penetrando en la fascia superficial con pinzas homeostáticas.
9. Abra con cuidado las pinzas homeostáticas para agarrar el extremo del cable del electrodo conectado al electrodo de platino sin permitir que los cables afilados se desvíen. Tire del cable a través del túnel hasta que el electrodo entre en la bolsa, orientado con el punto de soldadura hacia la extremidad posterior izquierda del roedor. Vuelva a colocar al roedor en la posición boca abajo.
10. Fije la placa de platino con una sutura sintética estéril, trenzada y no absorbible a la fascia pectoral en los dos orificios de las esquinas opuestas (se recomiendan 4-5 nudos para mayor estabilidad).
11. Del mismo modo, conecte el cable a la fascia con un nudo suelto, formando un ligero bucle antes de la entrada del túnel de tejido.
12. Cierre la piel con 3-4 suturas cutáneas, dependiendo del tamaño del corte (se puede usar el mismo material de sutura para el electrodo y el cable).

2. Procedimiento quirúrgico: Colocación del encaje de estimulación cerebral eléctrica transcraneal epicraneal (tES)

1. Coloque al animal en un marco estereotáctico.
   NOTA: Si usa anestesia por inhalación, reduzca la concentración del anestésico a un flujo de isoflurano de mantenimiento de ~ 1.5-1%, ajustado al reflejo de pellizco del dedo del pie y al patrón de respiración.
2. Desinfecte el cuero cabelludo afeitado como se describe en el paso 1.2.
3. Corte la piel con un bisturí en una línea desde el nivel rostral del ojo hasta el nivel de la oreja media.
   NOTA: Si se realizó la colocación del electrodo torácico, ya se han realizado los pasos 2.2 y 2.3.
4. Raspe el periostio (tejido conectivo del cráneo) hacia los lados con el bisturí y limpie bien con hisopos de algodón. Fije el tejido conectivo en las 4 esquinas del corte con pinzas bulldog y déjelas colgar lateralmente para mantener abierto el campo de la cirugía.
5. Aplique solución salina al 0,9% para limpiar la superficie ósea y el tejido con hisopos de algodón. Luego, limpie la superficie ósea con 3% de H₂O₂. Evite el contacto con el tejido. De este modo, el hueso se limpia más a fondo y se detendrá el sangrado menor del hueso. Además, los residuos del periostio se hacen visibles. Elimine estos residuos con un hisopo de algodón aplicando una presión moderada.
   NOTA: La eliminación de los residuos del periostio aumentará la adhesión y la durabilidad del encaje tES pegado al hueso.
   1. En caso de sangrado imparable, use un taladro óseo y tóquelo durante 1-3 s con una ligera presión sobre el hueso. Este procedimiento mecánico, en la mayoría de los casos, detendrá el sangrado sin un calentamiento significativo. Nunca use electrocauterio en el hueso; Incluso una aplicación breve provocará daño en el tejido cerebral (el electrocauterio debe usarse únicamente para el sangrado del tejido de la herida).
6. Como los tornillos de fijación mejorarán la adherencia a la configuración, elija una broca que se ajuste al tamaño del tornillo. Coloque dos orificios de rebaba en dos placas óseas diferentes perforando previamente con un taladro manual y luego aplicando una ligera presión vertical con el taladro óseo. Evite la proximidad a la posición deseada del zócalo tES, ya que podría dificultar el atornillado del electrodo (por ejemplo, para tES cortical motor primario izquierdo, elija la posición del tornillo parietal frontal derecho y posterior).
7. En el caso de un contraelectrodo implantado, rebaba un tercer orificio ubicado en el hueso parietal posterior derecho para la fijación futura del cable tunelizado.
8. Coloque los tornillos de plástico en los orificios de las rebabas y atornille hasta que se sienta la primera fricción. Luego realice tres giros de tornillo adicionales de 180 °. Verifique con fórceps la estabilidad del tornillo y agregue una vuelta más si no está lo suficientemente apretado.
   NOTA: Para ratas adultas, esto asegurará la colocación epidural de los tornillos sin dañar la duramadre o el cerebro (dependiendo del diseño de la rosca del tornillo, el número de vueltas puede variar). El uso de tornillos de acero inoxidable también debería ser factible, ya que incluso a densidades de corriente de DCS por encima del umbral de neurodegeneración; La colocación de los tornillos no perturbó la ubicación de la lesión ni la extensión por debajo de los tornillos.
9. Encienda el soldador y precaliente durante aproximadamente 5 min. Enrolle el cable que sale del túnel de tejido por vía occipital alrededor del tornillo parietal derecho y luego córtelo, dejando aproximadamente 1 cm de cable detrás del bobinado. Pele con cuidado el aislamiento al final del cable con un bisturí.
10. Fije el cable enrollado al tornillo y al hueso con pegamento cianoacrílico.
11. Aplique una pequeña cantidad de soldadura de estaño sin plomo al conector y a los cables desnudos del cable del contraelectrodo y conecte ambos presionando brevemente ambas partes presoldadas mientras toca la punta de soldadura hasta que la soldadura de estaño se derrita (aproximadamente 2-3 s). Retire la punta de soldadura inmediatamente para evitar el calentamiento excesivo del metal del cable con el consiguiente daño tisular.
12. Levante el casquillo del electrodo tES hecho a medida (Figura 1B, en rojo) con pinzas de punta dentada dobladas y aplique una fina capa de pegamento cianoacrílico en el borde inferior del encaje. Para colocarlo por encima de la corteza motora y utilizando un encaje de 4 mm de diámetro, coloque el punto medio de la cavidad a 2 mm anterior y 2 mm lateral del bregma. Para esta posición, el borde medial interno de la cavidad debe terminar directamente en la sutura sagital y el borde caudal debe terminar a la altura del bregma. Presione brevemente el encaje sobre el hueso (la mayoría de los pegamentos cianoacrílicos se endurecen por presión).
    NOTA: Colocar una fuente de luz directamente sobre el encaje puede facilitar la colocación del encaje.
13. Asegúrese de que el hueso dentro del área del alvéolo esté libre de pegamento (verificando con luz porque el pegamento es reflectante). En el caso de un derrame de pegamento, retire el encaje, raspe el pegamento con el bisturí y repita el paso 2.12.
14. Una vez que el alveolo esté en su lugar y el área de estimulación futura esté libre de pegamento, primero selle el borde lateral del alvéolo al tejido vecino con una pequeña gota de pegamento cianoacrílico para evitar un puente fluido que podría provocar una derivación de corriente en este lugar. No aplique demasiado pegamento, ya que puede fluir hacia el área de estimulación (si esto ocurre, regrese al paso 2.12).
    NOTA: Mantener el área de estimulación libre de pegamento es crucial, ya que una reducción del área de estimulación podría aumentar drásticamente la densidad de corriente (A / m²).
15. Cubra todos los tornillos con pegamento cianoacrílico.
16. Mezcle el cemento acrílico dental de dos componentes en un pequeño tubo de silicona o vidrio. Tan pronto como se vuelva viscoso, aplíquelo con una espátula dental para sellar los bordes restantes del alvéolo al hueso. Evite cualquier flujo de cemento acrílico dental en el área de estimulación.
17. Finalmente, cubra todo el cráneo, los tornillos, el cable del contraelectrodo y el zócalo hasta 1/3 del zócalo con cemento acrílico dental. Asegúrese de que el cemento tenga la viscosidad correcta: si es demasiado fluido, fluirá hacia el tejido circundante; si es demasiado duro es difícil distribuirlo uniformemente.
18. Cuando todo el hueso esté cubierto y el cemento esté endurecido, retire las pinzas de bulldog; la piel solo debe tocar el cemento acumulado para que no sea necesario suturar. (Si el corte inicial se eligió demasiado largo y el tejido conectivo o el músculo son visibles, aplique una sutura como se describe en el paso 1.12).
19. Aplique una capa de yodo con un hisopo de algodón alrededor del borde de la piel cortada e inyecte carprofeno por vía subcutánea (5 mg / kg de peso corporal disuelto en 5-7.5 ml de solución salina al 0.9% para el tratamiento del dolor y la reposición de líquidos).
    NOTA: Si usa anestesia por inhalación, apáguela ahora.
20. Coloque al roedor en una caja de calentamiento para que se recupere de la anestesia hasta que el roedor esté despierto y se restablezca la estabilidad postural.
    NOTA: Verifique diariamente el desarrollo del peso del animal, el estado de la herida y los criterios de bienestar general de acuerdo con la recomendación de la institución.

3. Procedimiento de estimulación eléctrica transcraneal

NOTA: Como la anestesia afecta los efectos de tES, se recomienda realizar la estimulación en roedores alerta siempre que sea posible. Deje que el roedor se recupere durante al menos 5 días (curación de la herida en la cabeza y el pecho) antes de comenzar los experimentos. Los experimentos se pueden realizar en puntos de tiempo más tempranos después de la cirugía cuando se usa un contraelectrodo externo fijado con un chaleco, ya que la herida en el pecho es más irritable, pero los animales deben estar acostumbrados al chaleco de electrodos durante varios días y puede ocurrir interferencia con las tareas de comportamiento.

1. Llene la mitad del zócalo del electrodo tES con solución salina al 0,9% y elimine las burbujas de aire.
2. Antes de las sesiones de estimulación catódica transcraneal de corriente continua (tDCS), siempre verifique la cloración y, si es necesario (como una superficie plateada brillante), vuelva a clorar el electrodo de Ag / AgCl. Antes de las sesiones de tDCS anódicas, elimine el posible exceso de depósitos de AgCl de las estimulaciones anteriores con papel de lija para permitir una buena conductividad durante la estimulación. Atornille el tapón de rosca del electrodo tES (Figura 1B, pieza gris).
   PRECAUCIÓN: Si no se vuelve a clorar el electrodo entre sesiones catódicas de tDCS, se agotará la cloración durante la estimulación y se acumulará tóxico por reacción electroquímica. Esto inducirá daño tisular. No es necesaria la recloración en una sola sesión si la duración de la estimulación es inferior a 20 min.
3. Conecte los cables a los dos conectores de la cabeza (para la estimulación anódica, el cable anódico está conectado al conector en la tapa de rosca, para la estimulación catódica, es lo contrario).
   NOTA: Cuando utilice un contraelectrodo colocado externamente, cubra el contraelectrodo con gel conductor y colóquelo sobre el pecho del roedor. Esto es más fácil si el electrodo está prefijado en un pequeño chaleco para roedores, que el roedor puede usar durante la estimulación.
4. Coloque al roedor en la jaula experimental, con los cables conectados a un eslabón giratorio sobre la jaula que permita el movimiento libre.
5. Encienda el estimulador y ajuste los parámetros de estimulación (intensidad de la estimulación, duración, tiempo de subida y bajada).
6. Cuando no utilice un dispositivo de estimulación disponible en el mercado con una alarma de desconexión y apagado de seguridad, incluya un medidor en el circuito para verificar el flujo de corriente constante.
   NOTA: Con esta configuración, la estimulación se puede aplicar durante la realización o el entrenamiento de tareas conductuales.
7. Verifique si hay signos de estrés o malestar en el roedor durante la estimulación.
8. Una vez finalizada la estimulación, desconecte los cables, desenrosque la tapa del electrodo en la cabeza y limpie y seque el zócalo con un hisopo de algodón. Regrese al roedor al entorno del hogar o proceda con un procedimiento de comportamiento si lo desea.

Resultados

Figura 1: Suministros para cirugía y esquema técnico de la unidad de casquillo y tapa de electrodo tES. (A) 1. Bastoncillos de algodón, 2. desinfectante, 3. marco estereotáctico, 4. soldador, 5. analgésico (p. ej., carp...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Softasept N	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland	3887138	Agente antiséptico
Etanol 70 %	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland	T913.1
Pinzas	de punta arqueadaHerramientas de ciencia fina FST, Heidelberg, Deutschland	11071-10
Pinzas de iris, 10cm, Rectas, Dentadas	World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, EE. UU., Inc, Sarasota, FL, EE. UU.	15914
Mango de bisturí # 3, 13 cm	World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, EE. UU., Inc, Sarasota, FL, EE. UU	500236
Hoja de bisturí estándar # 10	World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA	500239
Hisopos de celulosa Zelletten	Lohmann und Rauscher, Neuwied, Deutschland	13349	5 x 4 cm
Isoflurano	AbbVie Deutschland GmbH & Co	Tijeras
Iris, 11.5cm, Straight	World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA	501758	Tijeras pequeñas
Hisopo de algodón/bastoncillos de algodón	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland	EH12.1	Rotilabo
Kelly Pinzas hemostáticas, 14cm, Straight	World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, EE. UU., Inc, Sarasota, FL, USA	501241	Pinza quirúrgica
Placa de electrodos (platino)	hecha a medida	Wissenschaftliche Werkstatt Neurozentrum Uniklinik Freiburg, Deutschland	10x6 mm, 0,15 mm de espesor
Hilos de cobre aislados (~1 mm de diámetro)	Reichelt elektronik GmbH & Co. KG, Sande, Alemania	LITZE BL	Cable de electrodos
Weller EC 2002 M estación	de soldadura Weller Tools GmbH, Besigheim, Alemania	EC2002M1D
Iso-Core EL 0,5 mm	FELDER GMBH Löttechnik, Oberhausen, Alemania	20970510	Soldadura
sin plomoSUTURA de fibra de poliéster MERSILENE	Johnson & Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Alemania	R871H	Sutura trenzada no absorbible, 4-0
Histoacryl	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland	9381104	Cianoacrilato
Ketamin 10%	Medistar GmbH, Alemania	n/a	Anestésicos
Rompun 2% (Xilacina)	Bayer GmbH, Alemania	n/a	Anestésicos

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