Demostramos un método sencillo para colocar las células en los puntos deseados en un substrato. Este método de los patrones de las células al lanzar un chip de silicona que contiene micropocillos llena de células en el sustrato. Este método ofrece una nueva forma de modular la señalización difusibles y juxtacrine entre las células.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Los patrones de las células madre embrionarias usando el Flip Chip Bio
En este artículo
Resumen
Resumen
Interacciones célula-célula que consiste en la señalización difusibles y contacto célula-célula (juxtacrine señalización) son importantes en numerosos procesos biológicos como el crecimiento del tumor, la diferenciación de células madre y células madre de la auto-renovación. Una serie de métodos existen actualmente para modular la señalización celular in vitro. Uno de los métodos de la modulación de la cantidad total de la señalización difusibles es variar la densidad de siembra de células durante el cultivo. Debido a la naturaleza aleatoria de la siembra de células, esto se traduce en una variación considerable en la actual célula-célula y la cantidad de espacio de contacto entre células, y no puede prescribir el medio ambiente local. Un enfoque más específico para la modulación de la señalización celular es el uso de inhibidores moleculares o métodos genéticos para derribar a proteínas específicas de señalización, pero ambos de estos métodos son más adecuados para la manipulación de un pequeño número de moléculas. En este caso, se demuestra un nuevo enfoque para la modulación de las células de señalización celular que modula el ambiente local de un grupo de células mediante la colocación de diferentes números de células a los lugares deseados sobre un sustrato. Este método proporciona una forma complementaria para controlar la señalización local difusible y juxtacrine entre las células. Nuestro método se basa en el chip de Bio Flip (BFC), un chip de silicona que contienen cientos microfabricated a miles de micropocillos cada tamaño a suscribir una sola celda o un pequeño número de células. Cargamos el chip con las células simplemente pipeteando ellos en la matriz de los pozos y el lavado de las células sin carga fuera de la matriz. El chip es luego volcó sobre un sustrato, por el cual las células se caen de los pozos y en el sustrato, el mantenimiento de su patrón. Después las células se han unido, el chip se puede quitar (o la izquierda en). Este enfoque de modelado celular es único, ya que: 1) no altera la química del sustrato, lo que permite a las células proliferan y migran, 2) permite a los patrones en cualquier soporte, incluidos los de poliestireno de cultivo de tejidos, vidrio, matrigel, y incluso alimentación capas de células, y 3) es compatible con la impresión de microcontacto tradicionales, permitiendo la creación de islas de la matriz extracelular con células coloca dentro de las islas. En este vídeo, se demuestra el patrón de las células madre embrionarias de ratón en poliestireno de cultivo de tejidos con la BFC.
Protocolo
Hacer una BFC
BFC son hechas por moldeo polidimetilsiloxano (PDMS) en un 4 "oblea de silicio maestro.
Hacer una oblea de maestro
- Comience por la deshidratación de la obleas de silicio durante 30 minutos a 130 ° C.
- Lugar de la oblea en un spin-aplicador, vierta SU8-2050 (Microchem) sobre la oblea, rampa de 300 rpm / s de 3000-4000 rpm, y el giro de 30 s para obtener la altura característica de 40-30 mm, respectivamente.
- Después de girar, el lugar de la oblea en una placa 65 ° C, inmediatamente rampa encima de la temperatura a 95 ° C durante 5-6 minutos, y luego la ra....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Aunque el protocolo y el video se muestra aquí se describe el uso de la BFC un patrón de células madre embrionarias de ratón (mESCs), BFC se puede utilizar para patrón de prácticamente cualquier tipo de célula de interés. El único cambio que uno puede necesitar hacer es cambiar el tamaño de las cúpulas. En nuestra experiencia, para utilizar el BFC a las células de un patrón único de otro tipo de células, un diámetro de micropocillos y altura igual a 10 micrones mayor que el diámetro de la celda libre que funciona mejor.
B.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención EB007278.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Molde maestro de silicio | |||
| Placas de cultivo celular | Falcon BD | 35-3001 | 35 mm |
| Clips sujetadores de 3/4" | |||
| PBS | |||
| hexametildisiloxano | Shin-Etsu MicroSi | ||
| Artículo nuevo | MicroChem Corp. | SU8-2050 | |
| Acetato de PM | |||
| Isopropanol | |||
| BSA | 7,5 % de albúmina sérica bovina |
Referencias
- Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment. Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
