Summary
Легкий и удобный метод для определения степени разрыва связи трассирующими стыке нейронов сетчатки описано. Этот метод позволяет исследовать функцию электрических синапсов между нейронами в нетронутой сетчатки при различных условиях освещенности и в разное время дня и ночи.
Protocol
1. Неповрежденная нейронных подготовки сетчатки для золотых рыбок, мышей и кроликов
- Выполните все следующие шаги, в том числе описано в разделе "2) Cut-погрузка," под постоянной температуры окружающего воздуха (фона) освещения. Пожалуйста, обратите внимание, что для целей настоящего Протокола, процедуры описаны в исполнении в постоянной темноте (т.е. под очень темным (т.е. "скотопическое") условия ≤ 0,0001 люкс) с помощью инфракрасного ночного видения, очки, но и другие высшие уровни интенсивности постоянного окружающего освещения может быть использована вместо того, чтобы определить влияние других уровней окружающего освещения на разрыв связи соединения индикатора.
- Темно-адаптации экспериментальных животных (золотые рыбки, мыши или кролика), по крайней мере 1 час до операции.
- Как описано выше 7, глубоко обезболить золотая рыбка, помещая их в tricaine метансульфонат (MS222, 150 мг / л буфера (натрия бикарбонат-содержащие) воды аквариума), и глубоко обезболить мышей с кетамином (100 мг/ Кг, внутрибрюшинно) и rompun (10 мг / кг, внутрибрюшинно). Глубоко обезболить кроликов с уретана (нагрузочная доза: 2,0 г / кг, внутрибрюшинно), а также использовать местные интраорбитального анестезии (2% Xylocaine), как описано выше 8. Все экспериментальные процедуры, связанные с заботой и использования объектов животного мира должны проводиться в соответствии с федеральными руководящими принципами и рассматриваются и утверждаются местными животными университета ухода и использования комитетов. (Примечание:. В экспериментах, описанных здесь, все экспериментальные процедуры, связанные с заботой и использования рыбных, мышей и кроликов были проведены в соответствии с руководящими принципами, NIH и были рассмотрены и одобрены Университета штата Огайо по Уходу за животными и использованию комитет)
- Что касается рыб, мышей и кроликов, после энуклеации, удалить переднюю часть каждого глазного яблока. Затем поместите кусочек фильтровальной бумаги на верхней части задней части глаза и инвертировать фильтровальную бумагу и глаз, так что фильтровальная бумага находится под задней части глаза. Затем с помощью тонкойщипцами рассекают нетронутыми нейронных сетчатку от задней части глаза, осторожно пилинг от пигментного эпителия / сосудистое / склеры, которые крепятся друг к другу, из нервного сетчатки, которая крепится к фильтровальной бумаги. Как это делается, вырезать зрительного нерва с использованием тонких подпружиненные ножницы. Нейронных сетчатки, ориентированных фоторецепторных стороной вверх, теперь должен быть прикреплен к фильтровальную бумагу и отделен от остальной части глаза.
2. Cut-загрузки
- Погрузитесь сетчатки в растворе кислородом Рингера (табл. 1) в 6-луночного планшета (~ 5 мл / лунку) в течение 30 мин при постоянном окружающей среды (фона) освещения (например, под очень темным (т.е. "скотопическое") условиях) с или без испытание препарата. Поддерживать рыбы сетчатки в окисленной (5% CO 2 / 95% O 2) бикарбоната основе Рингера при 22 ° С, закрыв 6-луночный планшет с парафильмом и поддерживать мышь и кролика сетчатки при температуре 36 ° С в 5% CO 2 / 95% O
- Подготовка решения трассирующими (как правило, 100 мкл) путем растворения neurobiotin (0,5%), биотинилированного молекулы в растворе Рингера непосредственно перед проходящем через сетчатку. Обратите внимание, что 0,5% родамин декстрана (высокая (> 10 000) МВт) могут быть добавлены к решению. Благодаря своей высокой молекулярной массой, родамин декстран не пересекает щелевые контакты и только клетки метки, которые были повреждены в результате разреза. Как показано на рис. 3, это полезный способ отличить клетки, которые накопились neurobiotin, потому что они были ранены, из тех, которые накопились примеси путем диффузии через щелевые контакты.
- Место neurobiotin раствора на стекло (или пластик) чашки Петри, нажмите фильтровальная бумага, к которой прилагается сетчатки, на бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю Ringer, окуните лезвие (или другим острым лезвием) в растворе и neurobiotinн сделать радиального распила через сетчатку и фильтровальную бумагу. По желанию, прокладки могут быть использованы таким образом, чтобы сократить производится через сетчатку, но не фильтровальную бумагу. Сокращения должны быть ориентированы перпендикулярно поверхности сетчатки. Опустите лезвие в решении neurobiotin снова и сократить сетчатки во второй раз. Повторите это до 4-х резов в сетчатке глаза (см. рис. 1). Используйте рассекает микроскопом при принятии бритва прорезает мыши и другие мелкие сетчатки.
- Как показано на рис. 1, погрузиться сетчатки снова в средних свежих Рингера, с или без испытуемого препарата, используя 6-пластины и (5 мл Рингер / лунку). Инкубируйте сетчатки в течение 15 мин, чтобы обеспечить загрузку и диффузии.
- Промыть три раза в течение 5 минут каждая со средним свежие Рингера с или без испытуемого препарата.
- Fix сетчатки с 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатного буфера (PBS, рН 7,4) в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Промыть 0,1 М PBS в течение ночи при 4 ° C.
- На следующий день, реагируют ш2%-го стрептавидин-Alexa 488 (конечная концентрация 10 мкг / мл) в 0,1 М PBS + 0,3% Тритон Х-100, и держать в течение ночи при 4 ° C.
- Промыть три раза в течение 10 минут каждая с 0,1 М PBS при комнатной температуре
- В PBS, отделить сетчатку от фильтровальной бумаги и затем, используя тонкую кисть, место сетчатки, ориентированных фоторецепторных стороной вверх, на слайде.
- Аккуратно крепление с Vectashield монтажа среды (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
- Делайте кадры с лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (например, Zeiss 510 META) при том же увеличении, разрешение и настройки для каждой экспериментальной состоянии, чтобы можно было сравнить влияние различных экспериментальных условиях (например, наркотики испытаний; условий освещения) на степень щелевых контактов трассирующими связи (рис. 2A-C, а на рис. 4A-C). Хотя одно изображение может содержать все меченые клетки, рекомендуется, что вы собираете Z-Stack от области интересов и свернуть его в единуюизображения.
3. Количественная оценка трассирующими связи использованием ImageJ
- В обозревателя изображений LSM, откройте изображение, нажмите кнопку Экспорт и сохранить изображение как TIF-16 чуть не сжатый файл. Шкала баре должны быть включены в этот образ TIF.
- Использование NIH ImageJ программного обеспечения, измерение интенсивности флуоресценции Alexa-488 меченных neurobiotin с низким уровнем увеличения изображения целых монтажа сетчатки. Открытое TIF файл, используя ImageJ программного обеспечения и затем нарисовать прямую линию, соответствующую шкалы. К АНАЛИЗ, SET SCALE и ввести известное расстояние и единицу длины, а затем нажмите OK. Теперь результаты измерений могут быть представлены в калиброванных единицах, таких как миллиметров.
- Выберите область интересов использованием прямоугольное выделение. Пик флуоресценции должен располагаться на левой границы вашего выбора. Убедитесь, что нет сигнала флуоресценции около правой границы. Если нет, то вращаются активный образ (изображение, а затем поверните).
- НажмитеАнализ и УЧАСТОК ПРОФИЛЬ. Вы должны увидеть кривую с экспоненциальным затуханием слева направо.
- Нажмите кнопку Копировать в всплывающем окне и вставьте его в EXCEL. Теперь вы видите, две колонки показывающие расстояние от среза (левая колонка) и интенсивность флуоресценции в зависимости от расстояния от среза (правая колонка).
- Разделить каждую сырья флуоресценции значение, максимальное значение флуоресценции для получения относительной интенсивности флуоресценции.
- Копирование двух столбцов, соответствующих расстоянию от среза (X) и относительной интенсивности флуоресценции (Y), а затем вставить их в происхождении программного обеспечения.
- Fit с Экспоненциальное убывание функции # 1 (рис. 2 и рис 4D.), Который в виде:
Y = Y 0 + Y макс * ехр (-х / λ)
где Y является относительная интенсивность флуоресценции, У о является фоновой флуоресценции, Y макс является максимальной относительной флуоресценции, λ является зртуз (длина) постоянной, а х-расстояние от разреза. - Сравнить пространства постоянной (λ) значения в различных экспериментальных условиях с использованием T-тест или ANOVA (рис. 2E и рис. 4E). Обратите внимание, что альтернативные методы количественного были описаны другими 13,14.
4. Представитель Результаты
Типичными примерами фоторецепторных клеток трассирующими связи, как это определено сокращение загрузки представлены на рисунках 2 и 3 (рыба) и рис 4 (кролик). Конфокальной снимки были сделаны с использованием тех же параметров для сравнения (рис. 2A-C, а на рис. 4A-C) и интенсивность флуоресценции была построена в зависимости от расстояния от среза и оборудованы по экспоненциальной функции показано в п. 3.8 выше (рис. 2 и рис. 4D). Космические значения констант для каждого условияприведены на рис 2Е и 4E, иллюстрирующие, что степень разрыва связи переход трассирующими может быть количественно, используя отключения загрузки техники. Кроме того, результаты высоко воспроизводимыми. Использование отключения загрузки технику как средство количественной степени разрыва связи переход трассирующими также утверждены к выводу, что интенсивность флуоресценции уменьшается экспоненциально в зависимости от расстояния от среза во всех делах, рассмотренных 7,8 (см. также рис. 2D и 4D здесь), что свидетельствует о neurobiotin вошел через фоторецепторы вырезать бритвой, а не от других сетчатки сайтов. Кроме того, качественно подобны день / ночь разница в фоторецепторных связи трассирующими клетка наблюдается в золотую рыбку с инъекциями трассирующими в единую конусов и с вырезом загрузкой 7 обосновывает отключения нагрузки, относительно точный способ измерения степени связи фоторецепторов.
Отключения лoading метод также может быть использован для исследования других видов электрических синапсов в сетчатке. Например, на рисунке 5 показано, что кролик-типа (рис. 5а) и B-типа (рис. 5б) Горизонтальные клетки выставку гомологичных трассирующими связи следующее сокращение загрузки и распространения neurobiotin под темно-адаптированных условиях.
| Соединение | Рыба | Мышь | Кролик |
| NaCl | 130 | 120 | 117 |
| NaHCO 3 | 20 | 25 | 30 |
| NaH 2 PO 4 | - | 1 | 0,5 |
| KCL | 2,5 | 5 | 3,1 |
| Глюкоза | 10 | 10 | 10 |
| MgCl 2 | 1 | - | - |
| MgSO 4-7H 2 O | - | 1 | 1,2 |
| Глутамин | - | 0,1 | 0,1 |
| CaCl 2 | 0,7 | 2 | 2 |
Таблица 1: Состав растворов Рингера для золотой рыбки, мыши и кролика сетчатки. Концентрации приведены в мм. Решения Рингера которые пропускают с 5% CO 2 / 95% O 2 и выдерживают при 22 ° C (рыба) или 36 ° C (млекопитающих). "-": Не входит в Рингера для этого вида.
Рисунок 1:. Блок-схема показывает сокращение загрузки процедуры. После выделения ое нетронутыми нейронных сетчатки, несколько радиальных разрезов были сделаны лезвием, которое было впервые, смоченной в 0,5% neurobiotin решение. Сетчатка инкубировали трассирующими загрузки и распространения, а затем промывают до фиксации с 4% параформальдегида (PFA) в 0,1 М фосфатном буфере (PB). Tracer связи было рассмотрено использование стрептавидин-сопряженных Alexa-488.
Рисунок 2. День-ночь разница в связи фоторецепторов примеси в золотой рыбки раскрывается отключения загрузки техники. Фоторецепторных клеток щелевых контактов neurobiotin трассирующими связи была обширной в ночное время (B) и в день после применения спиперон (10 мкМ), селективных дофаминовых D 2-рецепторов (С), но не в день под контролем условий (А). D) Нормализованная относительной флуоресцентной интенсивности в зависимости от расстояния от разрезов (показаны стрелками в переменного тока). Е) проблема космического постоянной валзначениях, полученных из данных в D и других экспериментов (п = 4). *** P <0,001.
Рисунок 3. Представителем пример, показывающий, флуоресценции в слой фоторецепторов ячейки темно-золотой рыбки адаптированы сетчатки ночью следующие отключения нагрузки с решением обеих neurobiotin и родамина декстран. Родамина декстрана (показаны красным), которые не распространяют через открытые каналы щелевых контактов из-за его высокой молекулярной массой (> 10 000 МВт), только меченые клетки возле разреза. В противоположность этому, neurobiotin (показаны зеленым цветом) рассеянный через щелевые контакты и их можно увидеть в клетках фоторецепторов далеко от разреза. Расположение разреза, указанном стрелкой, в каждой панели. Шкала бар: 200 мкм.
Рисунок 4. День-ночь отличаютсяENCE в фоторецепторных трассирующими связи в сетчатке глаза кролика раскрывается отключения загрузки техники. Фоторецепторных клеток щелевых контактов neurobiotin трассирующими связи была обширной в ночное время (B) и в день после применения спиперон (10 мкМ) (C), но не в тот же день под контролем условий (А). В переменного тока, перпендикулярные виды 3D-реконструкция кролика возле фоторецепторов разреза показано на рисунке. D) Нормализованная относительной флуоресцентной интенсивности в зависимости от расстояния от порезов. Е) проблема космического постоянного значения, полученные из данных в D и других экспериментов (п = 3). *** P <0,001.
Рисунок 5. Cut-загрузки показывает, что темно-адаптированной кролика горизонтальные клетки трассирующими связаны. Оба типа (А) и B-типа (В) Горизонтальные клетки в темно-адаптированной сетчатки кролика выставлены гомологичных neurobiotin трассирующими связи.
Discussion
Сократить загрузкой метод, описанный здесь, полезные и просто технику, чтобы определить степень разрыва соединения трассирующими связи между нейронами сетчатки при различных условиях освещенности и в разное время дня и ночи. Преимущества этого метода включают в себя возможность количественно степень разрыва связи трассирующими соединения между нейронами в интактной ткани сетчатки при различных условиях освещенности в течение дня и ночью, и делать это для связанных нейронов, которые имеют небольшие somata диаметре. Ограничения техники в изучении щелевые контакты в интактной ткани падения на две основные категории. Во-первых, трассирующими диффузии через открытые переходы зазор может быть довольно трудно заметить из-за) малого диаметра или заряда, связанные с открытым каналам и б) относительные объемы связанных сотовой отсеков 1,14,15. То есть, трассирующими диффузии из маленькой камере с большим ячейку или группу связанных клетки, компared к трассирующими диффузии из больших ячейки меньше клетки, может быть более трудно обнаружить из-за разведения индикатора. Во-вторых, при некоторых физиологических состояниях, степень трассирующими диффузии через щелевые контакты в неповрежденной ткани могут не точно отражать силу разрыва соединительных проводимости из-за разницы в проводимости небольшого электрического тока ионы, по сравнению с проницаемостью относительно больших трассирующими молекул 1,14,15. В общем, доказательства трассирующими связи наводит на мысль, присутствие функционирования, открытых каналов соединения разрыв, но при некоторых физиологических состояниях, трассирующими диффузии может не произойти, или наблюдать, хотя электрофизиологические записи свидетельствуют о наличии функционирования, открытые переходы пробел.
Вполне вероятно, что сокращение загрузки метод также может быть использован для исследования степени разрыва связи трассирующими соединения между нейронами в неповрежденной ткани из других регионов центральной нервной системытемпература.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась NIH грант EY005102 к СКМ и EY018640 в КНР
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | 150 mg/L of buffered fish tank water |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | 2 g/kgloading dose |
| Dual Tube Night Vision Goggle | Night Optics USA | D-221 | |
| Filter Paper, Grade No. 4 | Whatman, GE Healthcare | 1004-090 | |
| Fine Forceps, Dumont No. 5, Biologie, 11 cm long | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Fine Scissors, spring-loaded, 8 mm blade, straight | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP-1120 | 0.5% |
| Streptavidin-conjugated Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | 2% |
| Dextran rhodamine(high (> 10,000) MW) | Invitrogen | D1817 | 0.5% |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Zeiss 510 META Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
| OriginPro 8.0 | OriginLab |
References
- Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain. Neuron. 41, 495-511 (2004).
- Connors, B. W., Long, M. A.
- Vaney, D. I. Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin. Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).
- Bloomfield, S. A., Völgyi, B. The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina. Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).
- Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine. Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).
- Xin, D., Bloomfield, S. A. Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina. Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).
- Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling. Neuron. 59, 790-801 (2008).
- Ribelayga, C., Mangel, S. C. Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina. PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).
- Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O'Brien, J. Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway. Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).
- Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP. Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).
- Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes. Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).
- Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimarães, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina. J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).
- Li, H., Chuang, A. Z., O'Brien, J. Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina. J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).
- Mills, S. L., Massey, S. C. The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina. Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).
- Mills, S. L., Massey, S. C. A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina. J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).
