Sistema de microinyección basado en microfluidos para infusión combinada de fármacos y electrofisiología

Resumen

Fuente: Vanegas, M. I., et al. Sistema Microinjectrode para infusión combinada de fármacos y electrofisiología. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra un dispositivo microfluídico basado en microelectrodos que administra una solución farmacológica a través de un tubo capilar, utilizando una solución marcadora a base de aceite para un seguimiento preciso del volumen y permitiendo el registro neuronal simultáneo y la infusión de fármacos.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Construcción del microinyector para estimulación y registro (Figura 1a)

1. Mida la longitud de la cánula y la sonda (en este ejemplo, un nanosensor). La sonda debe ser más larga que la cánula por la longitud que debe sobresalir de la punta de la cánula (dependiendo del diseño de la sonda), más aproximadamente 2 cm.
2. Bajo una lupa o un microscopio (aumento de ~10x), cargue la sonda en la cánula; si es posible, es preferible una carga posterior para proteger la punta de la sonda.
   NOTA: Este paso, realizado manualmente, es un desafío. Se recomienda practicar con un microelectrodo bajo una lupa antes de intentar con una sonda experimental real.
3. Pase la cánula (que contiene la sonda) a través de la férula superior, la unión en T y la férula inferior.
   1. Si la sonda es un solo cable sin accesorios, cárguela en la cánula e inserte el conjunto en la unión en T desde la férula inferior. La parte superior de la cánula (lado del extremo plano) debe colocarse en el medio de la unión en T, dentro de la parte inferior pero no en la férula superior. La sonda experimental o el biosensor deben sobresalir por encima de la parte superior de la férula.
      NOTA: Las férulas hechas a medida también se pueden hacer perforando un orificio en los tapones de la férula con microbrocas, el tamaño del orificio se basa en el diámetro necesario para apretar la cánula a la unión en T.
4. Use la llave de férula para apretar las férulas en la parte superior e inferior de la unión en T. No apriete demasiado. Se puede agregar un pequeño trozo de tubo para fortalecer el soporte del electrodo dentro de la férula superior.
5. Suelde pines dorados a cada uno de los terminales de la sonda (señal, tierra, etc.), de acuerdo con las especificaciones de la sonda.
6. Ajuste la posición relativa de la sonda y la cánula. Mida la distancia que la sonda sobresale de la cánula con aumento y ajústela manualmente desde el extremo superior (la sonda puede deslizarse libremente dentro de las férulas).
7. Agregue pegamento epoxi entre los pasadores dorados y la férula superior para unir la sonda a la férula.
8. Desenrosque la férula superior para retraer la sonda dentro de la cánula. Confirme visualmente que la sonda está completamente dentro de la cánula bajo aumento.
9. Conecte el inyector al microdrive.

2. Construcción del microinyector para infusión de fármacos (Figura 1b)

1. Fije el extremo "no biselado" o plano de la cánula a la parte inferior de la unión en T con una férula. Use la llave de férula para apretar la férula.
2. Conecte un pequeño trozo de tubo capilar (~ 1,5 cm) a la parte superior de la unión en T pasándolo a través de la férula estándar. Apriete con una llave de férula.
3. Retrocargue el microelectrodo a través del tubo capilar, la unión en T, la cánula y las férulas correspondientes.
4. Asegúrese de que el extremo posterior del electrodo sobresalga menos de 1 cm de la parte posterior del tubo capilar y que la punta del electrodo sobresalga de la cánula a la distancia deseada en la parte inferior. La posición del electrodo se puede ajustar manualmente desde el extremo superior.
5. Suelde un pin de oro al terminal del microelectrodo.
6. Agregue pegamento epoxi entre el pasador de oro y la férula superior para unir el microelectrodo a la férula.
7. Desenrosque la férula superior para retraer la sonda dentro de la cánula. Confirme visualmente que el microelectrodo está completamente retraído en la cánula.

3. Construcción del circuito microfluídico (Figura 2)

1. Coloque una placa de pruebas sobre una superficie estable. Coloque las dos válvulas de tres vías paralelas a los lados más largos de la placa de pruebas, aproximadamente 6 pulgadas. separados, con un puerto (el que siempre está abierto) uno frente al otro. Use tornillos para fijar las válvulas a la placa de pruebas.
2. Coloque una regla al lado de las válvulas (para medir y rastrear el movimiento de los fluidos dentro del tubo capilar).
3. Cargue una mezcla de aceite de baja viscosidad 1:1 y colorante alimentario (marcador) en la jeringa hermética al gas y colóquela en la bomba marcadora. Corte una pieza de tubo capilar y use férulas estándar y conectores Luer-lock para conectar la jeringa a uno de los puertos de la válvula de entrada. Esta es la "línea de marcador".
4. Corta un trozo corto de tubo capilar para la "línea de la regla". Utilice férulas estándar para apretar a los puertos enfrentados de las válvulas.
5. Corte dos piezas más largas de tubo capilar para conectar la válvula de salida al microinyector y para conectar la bomba de medicamentos a la válvula de entrada (use férulas estándar).
   NOTA: La longitud de estas dos líneas depende de la configuración experimental, una debe ser lo suficientemente larga para llegar desde el aparato de infusión hasta el animal y la otra desde la bomba de medicamentos hasta la válvula de entrada. Use una piedra de hendidura para cortar el tubo capilar.

4. Montaje del Microinjectrode en el Microdrive (Figura 3)

1. Asegúrese de que el microelectrodo/sonda experimental esté retraído en la cánula antes del montaje.
   NOTA: El tubo guía debe estar en una posición en el microdrive.
2. Conecte un adaptador hecho a medida al microinyectrode.
3. Cargue el microinyectrode a través del tubo guía y asegúrelo al adaptador con tornillos.
4. Mida la posición del microaccionamiento (profundidad) en la que el microinyector sobresale del tubo guía, luego retírelo ~ 1 cm para prepararlo para la inserción.
5. Para experimentos de microinfusión, conecte la "línea cerebral" a la abertura de unión en T no utilizada del microelectrodo. Use una férula estándar y apriétela con una llave de férula.

5. Lavado y preparación del sistema microfluídico

1. Coloque el microaccionamiento con el microinyector sobre un vaso de precipitados de desechos.
2. Cargue clorhexidina (p. ej., nolvasan, disuelta a 20 g/L) en la jeringa hermética a gas de 1 ml y colóquela en la bomba de medicamentos. Gire la dirección del flujo de las válvulas de modo que el fluido vaya de la bomba de drogas a través de la válvula a la línea de la válvula y salga por la "línea del cerebro".
3. Enjuague el circuito con clorhexidina utilizando un caudal bajo (50-200 μL/min) durante un mínimo de 10 min. Repita los pasos 5.2 a 5.3 con solución salina estéril y luego aire.
   NOTA: Es importante comprobar si hay fugas en esta etapa. Aplique suavemente toallitas sin pelusa en las uniones para ayudar a revelar cualquier fuga de líquido a través de las férulas.
4. Cargue el medicamento en la jeringa hermética a los gases de 500 μL, comprima el aire y luego colóquelo en la bomba de medicamentos. Fluir a 50 μL/min hasta que salgan unas gotas del microinyectrode.
5. Remojar el tubo guía en clorhexidina (disuelta a 20 g/L) durante 15 min.
6. Gire la dirección de la válvula de salida hacia la "línea de lavado". Avance la bomba del marcador hasta que se observe un borde claro de color y aceite en la línea de la regla. Asegúrese de que siempre haya aceite entre el medicamento y el color para no mezclar los dos materiales solubles en agua y perder el borde afilado entre ellos. Marque la posición inicial de esta línea de aceite / tinte (con un trozo de cinta adhesiva o marcador).
7. Gire la dirección de la válvula de salida hacia la línea cerebral.

6. Realización de un experimento de grabación o infusión

NOTA: Los pasos de manejo de animales variarán según el laboratorio y el experimento. Los siguientes pasos deben realizarse después de la configuración quirúrgica necesaria y la preparación para exponer la duramadre. Después del experimento, todos los pasos necesarios posteriores al procedimiento deben realizarse de acuerdo con los protocolos aprobados institucionalmente.

1. Conecte el microdrive a la cámara de grabación. Baje el tubo guía para penetrar en la duramadre.
   NOTA: El tubo guía no debe penetrar más allá de la duramadre para evitar dañar la corteza.
2. Baje el microinyectrode a unos 2 mm por encima del sitio para el registro / inyección en el cerebro.
3. Apriete la férula superior (microelectrodo/biosensor que sobresale) y conecte los pines dorados al sistema de grabación. Siga avanzando el microinyector hasta el sitio objetivo.
   NOTA: Recuerde incluir la distancia que el microelectrodo se extiende más allá de la cánula en los cálculos.
4. Para experimentos de infusión, use la bomba de microjeringa manual para mover la columna de aceite 1 cm cada 3 minutos (~ 60 nL / min). Una vez que se haya infundido el volumen deseado, cambie la válvula de salida hacia la línea de lavado.
   NOTA: El volumen infundido variará según la especie modelo y el área del cerebro objetivo. Las tasas de flujo más rápidas pueden dañar el tejido neural.
5. Cuando se completen los experimentos, retraiga el microinyectrode dentro del tubo guía (deje la sonda sobresaliendo). Luego retire el microdrive para enjuagar. Enjuague el sistema microfluídico para prepararlo para su reutilización. nota: En nuestra experiencia, el microinyector durará varios usos si se tiene el cuidado adecuado. La calidad del registro electrofisiológico cae más rápido que la capacidad de inyección.

Resultados

Figura 1: Fabricación paso a paso de microinyectores.) Configuración para uso independiente del sistema microfluídico. La cánula y la sonda se miden para confirmar que la punta de la sonda puede sobresalir a la longitud desea...

Materiales