Administración de sustancias dirigidas al cerebro del ratón mediante infusión en la arteria carótida interna

Resumen

Fuente: Leda, A. R., et al. Técnica de infusión de microcirugía de ratón para la administración de sustancias dirigidas en el SNC a través de la arteria carótida interna. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra un procedimiento microquirúrgico diseñado para facilitar la infusión dirigida de una sustancia de prueba en el cerebro a través de la arteria carótida interna (ICA). El procedimiento implica suturas precisas y manipulación vascular para restringir temporalmente el flujo sanguíneo, asegurando un parto controlado. Se inserta un tubo capilar en la arteria carótida externa (ECA) y se avanza hacia la bifurcación. Tras la infusión, la sustancia evita la circulación sistémica, cruza la barrera hematoencefálica y logra una administración dirigida al parénquima cerebral.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de ratones para cirugía

1. Anestesiar ratón con isoflurano mezclado con oxígeno, utilizando un sistema de anestesia de laboratorio. Use isoflurano a una temperatura entre 4-5% y flujo de oxígeno a 2 L / min en la máquina comercial (consulte la tabla de materiales). Transfiera al animal a la superficie de la cirugía, bajo un microscopio estereoscópico, y mantenga la anestesia con un cono nasal (use isoflurano en configuración 1.5 - 2.5 y flujo de oxígeno a 2 L / min).
   1. Asegúrese de que la frecuencia respiratoria del ratón sea de alrededor de 1 a 2 respiraciones/seg sin jadear. Además, asegúrese de que el animal no muestre una reacción de estimulación de bigotes y un reflejo pedal (pellizco de los dedos de los pies). Controle la frecuencia respiratoria y el esfuerzo durante la cirugía, al menos cada 5 minutos. Siga las pautas veterinarias específicas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales para el monitoreo de la anestesia de roedores.
2. Aplique una gota de lubricante oftálmico en cada ojo con un hisopo estéril para evitar la sequedad. Se recomienda la administración de antiinflamatorios y analgésicos para aliviar las molestias.
3. Con el animal acostado boca arriba, mantenga la anestesia usando un cono nasal.
4. Limpie el área del cuello del animal limpiando el área tres veces con etanol al 70% y clorhexidina. Afeitar el área de cirugía del animal con una navaja de afeitar (se detalla a continuación).

2. Disección de la arteria carótida común (CCA)

1. Realice todo el procedimiento de microcirugía bajo un microscopio estereoscópico. Con tijeras quirúrgicas y fórceps, realice una incisión superficial en la línea media del cuello, desde arriba del esternón hasta debajo de la mandíbula (aproximadamente 3 a 4 cm).
2. Con fórceps, separe cuidadosamente el tejido graso y conectivo para exponer la tráquea.
3. Coloque una almohada (objeto redondo, de unos 0,5 cm de diámetro) en la parte posterior del cuello del ratón para extender el cuello, exponiendo aún más el área.
4. Separe el tejido usando un retractor de tejido o ganchos.
5. En el lado izquierdo de la tráquea del animal, separe con cuidado el tejido conectivo para exponer el CCA izquierdo.
6. Con fórceps, retire con cuidado todo el tejido conectivo para exponer la bifurcación de CCA y el comienzo de las arterias carótidas externas e internas.

3. Preparación del CCA para infusión de sustancias

1. Inserte dos segmentos de sutura de nailon (aproximadamente 1 cm cada uno) debajo de la arteria carótida externa (ECA), utilizando fórceps.
2. Coloque un nudo permanente en el punto más alto posible del ECA.
3. En el punto más bajo posible del ECA, inmediatamente por encima de la bifurcación de la CCA, coloque un nudo extraíble. Este nudo debe estar suelto en comparación con el nudo superior.
4. Cierre el CCA con un clip de recipiente, en el punto más bajo posible.
5. Cierre la arteria carótida interna (ACI) con un clip para vasos.
6. Con unas tijeras de resorte de microdisección se realiza un pequeño corte en el ECA (unos 2 mm), entre los dos nudos.

4. Infusión de sustancias a través de ICA

1. Ensamble un sistema de infusión. Conecte 6 pulgadas de tubo capilar (dimensiones ideales: 2,5 mm x 1,2 mm) a una jeringa de tuberculina que contenga 250 μl de la sustancia a infundir (medicamentos, patógenos, vesículas extracelulares, entre otros) e inserte la punta capilar suavemente en la incisión realizada en el paso 3.6.
2. Continúe deslizándose por el capilar hasta que alcance un punto medio entre la bifurcación y el clip que cierra el CCA.
3. Ate el nudo ECA inferior. Verifique que el nudo esté lo suficientemente suelto para permitir la fluidez capilar y lo suficientemente apretado para evitar fugas.
4. Retire el clip del ICA.
5. Aplique presión suavemente al pistón de la jeringa permitiendo la infusión de sustancia a aproximadamente 10 μl por segundo.

5. Procedimientos posteriores

1. a la infusión Coloque el clip en el ICA.
2. Retire suavemente el tubo capilar.
3. Ate completamente el nudo ECA inferior.
4. Retire los clips del ICA y el CCA.

6. Cierre de la incisión y cuidado postoperatorio

1. Retire el retractor o los ganchos de tejido y la almohada.
2. Limpie el área de sutura con solución salina estéril.
3. Cierre la incisión con sutura/aguja de nailon y fórceps.
4. Administrar antiinflamatorios y analgésicos para aliviar las molestias postoperatorias.
5. Coloque al animal en una jaula colocada sobre una almohadilla térmica durante al menos 1 hora y controle la recuperación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Instrumento de anestesia	Vetequip	901806
Tijeras quirúrgicas	Fine Science Tool	14558-09
Pinzas quirúrgicas de punta recta	Fine Science Tool	00108-11
Pinzas quirúrgicas de punta en ángulo	Fine Science Tool	00109-11
Tijeras de resorte	Fine Science Tool	15000-08
Sutura de nylon	Braintree Scientific	SUT-S 104
Tubo capilar (Micro-Renathane 0.010" x 0.005" por pie)	Braintree Scientific	MRE01050
Sutura de cierre	VWR	95057-036
Isoflurano	Piramal
2,3,5-Trifeniltetrazolio cloruro	FisherScientific	50-121-8005