La purificación de Hsp104, una proteína Disaggregase

Resumen

Aquí se describe un protocolo para la purificación de gran actividad Hsp104, un AAA hexameric + proteína de la levadura, que se acopla la hidrólisis de ATP con el desglose de proteínas. Este esquema se aprovecha de una construcción de His6-etiquetados para la purificación de afinidad de E. coli Seguido por cromatografía de intercambio aniónico, His6-tag con la eliminación de la proteasa TEV, y la cromatografía de exclusión por tamaño.

Resumen

Hsp104 es un hexameric AAA + proteína ¹ de la levadura, que se acopla la hidrólisis del ATP a la proteína de desagregación ^2-10 (Fig. 1). Esta actividad se imparte dos ventajas selectivas clave. En primer lugar, la renaturalización de los agregados desordenados por Hsp104 faculta la supervivencia de hongos después de varios mal plegamiento de proteínas, destaca, como golpe de calor ^3,5,11,12. En segundo lugar, la remodelación de las fibrillas de amiloide-beta cruzada por Hsp104 permite a la levadura para explotar miles de priones (amiloides infecciosas) como un reservorio de beneficios y las variaciones hereditarias fenotípica ^13-22. Sorprendentemente, Hsp104 directamente remodelaciones oligómeros preamyloid y fibrillas de amiloide, incluyendo los que forman parte de las proteínas de priones de levadura Sup35 y ^23-30 Ure2. Esta funcionalidad-amiloide remodelación es una faceta especializada de la levadura Hsp104. La E. orthologue coli, CLPB, no oligómeros preamyloid remodelar o fibrillas de amiloide ^26,31,32.

Ortólogos Hsp104 se encuentran en todos los reinos de la vida, excepto, sorprendentemente, los animales. En efecto, si las células animales poseen un sistema enzimático que desglose las parejas de proteínas para la renaturalización (en lugar de la degradación) sigue siendo desconocido ^33-35. Por lo tanto, nosotros y otros han propuesto que Hsp104 podría ser desarrollado como un agente terapéutico para diversas enfermedades neurodegenerativas relacionadas con el mal plegamiento de proteínas específicas en oligómeros preamyloid tóxicos y fibrillas de amiloide ^{4,7,23,36-38.} No existen tratamientos que afectan directamente a las especies agregados asociados a estas enfermedades. Sin embargo, se disuelve Hsp104 oligómeros tóxicos y fibrillas de amiloide compuesto de alfa-sinucleína, que se relacionan con la enfermedad de Parkinson ^23, así como las formas de PrP-amiloide ^39. Es importante destacar que Hsp104 reduce la agregación de proteínas y mejora la neurodegeneración en modelos de roedores de la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington ^{23 38.} Lo ideal sería que, para optimizar el tratamiento y minimizar los efectos secundarios, Hsp104 sería diseñado y potenciado para remodelar de forma selectiva agregados específicos en el centro de la enfermedad en cuestión ^4,7. Sin embargo, la limitada comprensión estructural y mecánica de cómo Hsp104 desagrega un repertorio diverso de las estructuras de agregados y proteínas no relacionadas frustra los esfuerzos ^30,40-42.

Para comprender la estructura y el mecanismo de Hsp104, es esencial para el estudio de la proteína pura y reconstituir su actividad disaggregase con un mínimo de componentes. Hsp104 es una proteína con un pI 102kDa de ~ 5.3, que hexamerizes en presencia de ADP o ATP, o en las concentraciones de proteínas en ausencia de nucleótidos ^43-46. Aquí se describe un protocolo optimizado para la purificación de la muy activa, estable Hsp104 de E. coli. El uso de E. coli permite simplificar en gran escala de producción y nuestro método se puede realizar de forma rápida y fiable para numerosos Hsp104 variantes. Nuestro protocolo aumenta Hsp104 pureza y simplifica _6-Su etiqueta de la eliminación en comparación con un método de purificación previa de E. coli ^47. Por otra parte, el protocolo es más fácil y conveniente de dos protocolos más recientes ^26,48.

Protocolo

1. Expresión de Hsp104

1. El plásmido utilizado para la purificación de E. coli, pPROEX-HTB-Hsp104, contiene el Hsp104 abierto marco de lectura bajo el control inducible del promotor trc ^26. El plásmido produce con su Hsp104 un N-terminal _6-etiqueta que se puede quitar por escisión de la proteasa TEV. Transformar pPROEX-HTB-Hsp104 en el codón-optimizado E. coli BL21-CodonPlus-RIL células (Stratagene, Agilent Technologies) mediante un procedimiento típico de la transformación bacteriana (por ejemplo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante). Es importante usar un codón de E. optimizado coli<....

Discusión

Cronología: Para la máxima actividad Hsp104 se recomienda que el esquema de purificación se complete toda la mayor rapidez posible. Sin embargo, el número de etapas de purificación hace un exigente calendario que no siempre es práctico. Si las etapas de purificación se lleva a cabo lo más rápidamente posible, el tiempo desde el final de la expresión a través de la noche a la 02.04 horas de incubación a 30 ° C con TEV proteasa es de aproximadamente 9-11 horas. Un lugar potencial para hacer una pausa es después del.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
BL21-CodonPlus-RIL células competentes	Stratagene, Agilent Technologies	230255
2XYT caldo	USB	75864
Completo, minibar, EDTA libre de tabletas de inhibidores de la proteasa	Roche	1836170
A pepstatina	Sigma	P4265
Ni-Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare	17-5318-02
Amicon Ultra-15 unidades centrífugas filtro (MWCO 30.000)	Millipore	UFC903008
Recursos Q - columna 6 ml	GE Healthcare	17-1179-01
proTEV de la proteasa	Promega	V6052
AcTEV de la proteasa	Invitrogen	12575015
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare	17-5172-01
Hsp40	Diseño del ensayo	SPP-400
Hsp72	Diseño del ensayo	ADI-NSP-555