Cercarial转型和在体外栽培曼氏血吸虫 Schistosomules

Summary

我们描述了一个

Abstract

血吸虫寄生虫病，血吸虫病，长期衰弱的疾病，影响全球超过200万人次，跻身在公众健康和社会经济的影响（1-4）方面寄生虫病的第二个疟疾的病原体。血吸虫寄生虫吸虫蠕虫，软体动物和哺乳动物的主机之间的寄生生活，一个复杂的生命周期转乘干预自由游动阶段。简言之，自由游动的尾蚴感染哺乳动物的主机，通过穿透皮肤分泌的蛋白酶的援助，在这段时间内尾蚴失去它们的尾巴，schistosomules改造。现在schistosomules必须逃避宿主的免疫系统，开发出红血细胞的消化肠道，并迁移虽然肺部，他们在肝门系统的最终目的地途中门静脉循环和最终肠系膜静脉（曼氏血吸虫）其中男性和女性对蠕虫和队友，每天生产数百个鸡蛋。有些是从体内排出的鸡蛋，鸡蛋孵化成自由游动的毛蚴（5-10）到淡水。毛蚴感染特定的蜗牛种，并转化为母亲和女儿sporocysts，这反过来，产生感染尾蚴，完成生命周期。不幸的是，整个生命周期血吸虫不能在体外培养，但可以转化成schistosomules感染尾蚴，schistosomules可周的培养，在体外或微阵列分析分析血吸虫发展。在这个协议中，我们提供了一个可视化描述cercarial改造， 并在体外培养的schistosomules 。我们从蜗牛主机Biomphalaria光滑棚感染尾蚴和手动变换成schistosomules使用乳化针双端分离它们​​的尾巴。 体外 cercarial的改造和schistosomules养殖技术的描述，避免使用哺乳动物的主机，从而简化了血吸虫的可视化和便于实验分析收集的寄生虫。体外转化和血吸虫培养技术多年来一直做的（11， 12），但没有视觉的协议已经开发了整个社会。

Protocol

安全措施：

血吸虫尾蚴可直接穿透皮肤没有削减或毛孔需要，造成慢性疾病血吸虫病。S。血吸虫是一个生物安全2级的有机体，因此，适当的个人防护设备和感染尾蚴的工作时，必须遵循适当的安全措施。大多数必要的设备，成长和改造血吸虫是标准的，表中所指出的，该协议的结束与几个关键例外。所有的cercarial工作应该做在一个孤立的房间。 Schistosomules应培养在无菌的，经批准的生物安全罩。应佩戴两层腈或乳胶手套，实验室外套，一双防水的鞋子，裤子没有洞或泪水，并为您的手腕和手臂防水袖保护。在一个偶然泄漏的情况下，立即喷用70％乙醇或10％漂白粉的受污染的地区，揉大力如果你的人。这将是足以禁用的寄生虫，但所有可能感染的，应当报和重视。虽然schistosomules是不是天生感染，机构准则各不相同，应征询，以确定是否BSL2的预防措施，在非感染性的人生阶段所需的。来与任何潜在的感染性物质接触后，实验是在经批准的生物危害容器中进行丢弃废物的所有表面消毒。

注：盖蜗牛主机箱1〜2天前脱落和保护由轻

1。收获尾蚴从蜗牛主机

1. 填写一个干净，洗涤剂中途平衡至室温，用蒸馏水500ml烧杯。如果在不同的日期与毛蚴感染主机蜗牛的正常工作，使用感染日期为每一个单独的烧杯中（如果蜗牛将会为未来的实验中重用，这一点尤为重要）。烧杯的大小也可根据用户体验。
2. 收集你想摆脱仔细存款，他们使用一个标准的观赏鱼的网和通用钳需要烧杯中的受感染的蜗牛主机。
3. 泄漏应急放在烧杯托盘白炽灯光源下约8至12英寸。让我们站在为1-2小时，在灯光下。尾蚴离开蜗牛主机，当暴露在明亮的光线。
4. 仔细筛选出从尾蚴混合物蜗牛。采取额外的安全防范措施，作为混合物具有高度传染性。记住，尾蚴可直接穿透人体的皮肤！
5. 更换光源下约15分钟的混合物，使任何微粒废物问题解决。
6. 转移到一个干净的锥形烧瓶中，用吸管的尾蚴，避免在烧杯底部的碎片。烧瓶放置在约45 ° 45在黑暗中的冰角 - 60分钟，允许尾蚴融入一个角落。
7. 使用50 mL的吸管，去除75％至90％的上清液和存款中含10％漂白粉或70％乙醇的烧杯中，小心不要让水滴含有尾蚴从吸管滴。
8. 摇动三角瓶中含有尾蚴轻轻悬浮在溶液中的尾蚴。使用吸管样品转移到无菌50 ml锥形管。放在冰管，再次为在黑暗中20分钟。尾蚴将解决对试管底部，在黑暗中。

2。手册转型的尾蚴schistosomules

开始之前：RPMI 1640完全“（5％胎牛血清的RPMI，1X笔/链球菌）和温暖至37 ° C。 （这是至关重要的，已孵化灭活胎牛血清使用56℃，1小时可以作为血吸虫敏感的补充）。

1. 在生物危害罩，取出上清下降到5至10毫升每50 ml锥形解决方案，使用移液器或真空设备。
2. 22计双端连接，露儿乐乳化针，以适当大小的注射器。
3. 慢慢地拉入注射器的混合物。收集来自所有50毫升注射器管的尾蚴。滴水周到。
4. 小心地翻过来，这样，独立的针尾注射器。将另一注射器乳化针的这一边。
5. 穿过针的混合物的40倍（20倍来回），改造尾蚴。
6. 位置垂直等混合物包含在底部注射器和顶部的注射器是空的注射器。卸下顶部的注射器和70％乙醇消毒。
7. 存款下降混合物放入一个干净的高壁百毫米x 50毫米耐热盘或结晶盘。 70％乙醇消毒针头和注射器。
8. 添加37℃的RPMI 1640完整的媒体，如培养皿的底部完全覆盖，仿佛一个卢里亚肉汤板浇筑。
9. 涡流轻轻收集在培养皿的中心schistosomules。避免飞溅。
   注意：它可能是有用的这一步关闭罩灯，以更充分的可视化中心schistosomules的。
10. 立即存入一个新的12孔细胞培养板使用无菌滴管集中schistosomules。
11. 直到schistosomules菜（约10倍）的中心不再重复2.9和2.10。定金随后每一个新鲜以及的集合。
12. 填写半途而废（〜1.5毫升）预热的RPMI完整的媒体。
13. 倒置显微镜，可视化，以验证schistosomules和尾蚴的情况下是否存在。
14. 成长中的CO ₂培养箱schistosomules设置为37 ° C和5％的CO _2。

3。代表性的成果：

待转让schistosomules转化成文化传媒，下一个倒置的明场显微镜（见设备表为例）可​​视化应该产生一个类似于图1，其中只有转化schistosomules以及在目前的图像。潜在的污染物可能包括完整的尾蚴，切断cercarial尾巴，或其他杂物。如果没有倒置显微镜，一个标准的显微镜，甚至清扫范围，将有足够的schistosomules可视化。注意，此过程并不总是变换尾蚴的100％。

图1：转化Schistosomulum

图2：尾蚴和痛苦的尾巴

Discussion

在改造过程中可能出现的几个潜在的问题;然而，这个协议是为了避免这些问题大部分。一个潜在的危险是乳化针，这通常会出现由于在步骤1.3中的收获遗留下来的碎片堵塞。一定要允许所有的颗粒物质，解决在步骤1.5和转让步骤1.6尾蚴仔细，以避免这个问题。此外，如前所述，内生物安全柜工作，个人防护装备的使用（甚至面罩），避免过度的压力注射器最好。

分离cercarial尾巴可以在媒体上，这是贫困分离在步骤2.9可视化。尾巴表现出痉挛般的议案，并有不同的形状（见图2），而正是如此很容易分辨的schistosomules。可去除清洗多余的RPMI schistosomules完成schistosomules解决的尾巴。尾巴将保持浮动，并可以清理。

如果完整的尾蚴是目前在媒体上，在改造步骤2.5无法被正确执行。一个完整的尾蚴的形象描绘在图3b中，以供参考。如果发生此问题，确保正在使用的乳化针是适当的大小。此外，可以增加cercarial混合物是通过针通过倍，40倍，虽然通常比足够接近100％剪切cercarial尾巴。

尾蚴转化成schistosomules科利和Wikel（13）于1974年首次描述。从那时起，schistosomules准备已经完成在本议定书中，或使用一个振荡的方法和percoll梯度分离（14，15）或纷飞在这纸证明，使用针头和注射器剪切战略。这两种技术准备schistosomules精美的弗雷德刘易斯（16）和进一步培养长期增长schistosomules的信息，可在NIAID的血吸虫资源中心（ www.schisto resource.org ）。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
22g x 2-7/8" Emulsifying needle	Fisher Scientific	14-825-17G
RPMI 1640 Medium 1X (500ml)	Invitrogen	11835030
Fetal Bovine Serum (FBS) heat inactivated	Invitrogen	10082139
Penicillin/Streptomycin (100X)	Invitrogen	15070063
Crystallizing Dish (100mm)	Fisher Scientific	08-741D
General Purpose Tweezers	Fisher Scientific	10-316C
Petco Aquarium net for brine shrimp	Petco	SKU:1190954