Method Article

Preparación de Synaptoneurosomes de ratón con una corteza discontinua de Percoll-sacarosa gradiente de densidad

DOI:

10.3791/3196

⸱

September 17th, 2011

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin, 2Department of Biochemistry, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un método para preparar translationally activa, synaptoneurosomes intacta (SN) de la corteza cerebral del ratón se describe. El método utiliza una discontinua de Percoll-sacarosa gradiente de densidad que permite la rápida preparación de los ganglios centinela activa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synaptoneurosomes (SN) se obtienen después de la homogeneización y fraccionamiento de la corteza cerebral del ratón. Que se hara vesículas o terminales aislados que rompen con terminales de los axones en el tejido cortical se homogeneiza. El SNS conservar las características pre-y post-sináptica, lo que hace que sean útiles en el estudio de la transmisión sináptica. Conservan la maquinaria molecular utilizados en la señalización neuronal y que son capaces de captación, almacenamiento y liberación de neurotransmisores.

La producción y el aislamiento de ganglios centinela activa puede ser problemático, utilizando como medios de Ficoll, que pueden ser citotóxicos y requieren centrifugación extendido debido a la alta densidad, y la filtración y el método de centrifugado, que puede resultar en una baja actividad debido a los daños mecánicos del SNS. Sin embargo, el uso de gradientes de densidad de sacarosa discontinua de Percoll para aislar SN proporciona un método rápido para producir un buen rendimiento del SNS translationally activo. El método del gradiente de Percoll-sacarosa es rápida y suave, ya que emplea a condiciones isotónicas, tiene menos y más cortas tiradas centrifugación y evita pasos de centrifugación que la SNS pellet y causar daños mecánicos.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparativos 4.1

  1. Preparar 500 mL de tampón de gradiente medio (GM) al mezclar 50 ml de una suspensión de sacarosa 2,5 M, 2,5 ml de 1M Tris-HCl, pH 7,5 acciones, y 0,1 mL de EDTA 0,5 M, pH 8,0 con valores de mili- Q agua a volumen. Filtro de esterilización de la solución, alícuota y almacenar congelado.
  2. Preparar un stock de 1.000 veces la tetrodotoxina (TTX), haciendo una solución 1 mM en mili-Q H 2 O. Alícuotas de TTX se pueden almacenar a -20 ° C.
  3. Prepare el buffer de la estimulación de 10x por lo que una solución de 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM KH 2 PO 4, 40 mM NaHCO 3, y 800 mM de NaCl en agua milli-Q. De archivo se pueden almacenar a 4 ° C.
  4. Pre-enfriar centrifugadoras a 4 ° C.
  5. Prepare una solución madre de Percoll isotónico (SIP) mediante la adición de 9 volúmenes de Percoll (18 ml) a un volumen de 2,5 M de sacarosa (2 ml) en agua milli-Q y mezclar bien.
  6. Prepare el 3, 10, 15 y 23% mediante la adición de capas de gradiente de las cantidades respectivas de la SIP a GM de amortiguación y de mezcla de cada uno:

Tabla de la serie Gradient; datos de la solución tampón; concentración vs. porcentaje de gradiente; investigación.

  1. Vierta capas de gradiente con pipeta 2 ml cada uno de los 23, 15, 10, y un 3% las soluciones de Percoll isotónico en los tubos de centrífuga Beckman con tapas con un P1000 Gilson Pipetman. La interfaz entre las capas deben ser claramente visibles sin que se mezclen las capas. Tienda de los gradientes a 4 ° C durante al menos 20 minutos antes de su uso. Los gradientes se pueden almacenar hasta 24 horas, aunque el uso mismo día se recomienda. [Personal sin experiencia práctica de laboratorio pueden preparar mediante la adición de los gradientes de tinte azul para el isomotic soluciones de Percoll para la visualización de las interfaces de capa.]

2. Ratón una disección

  1. Asegúrese de que todos los cría del ratón y la eutanasia procedimientos se realizan de acuerdo con las directrices de los NIH y la Universidad. La eutanasia a los cachorros (edad P13 a P21) por asfixia de dióxido de carbono o por un método aprobado en el protocolo de los animales.
  2. Pin con el ratón a una tabla de disección y rociar la parte posterior del cuello y la cabeza con etanol. Usando unas tijeras afiladas cortar a través de la médula espinal en la base del cráneo, quitar la piel de la parte superior del cráneo, corte lateral del cráneo entre el hueso parietal y hueso interparietal o entre el cerebro y las regiones de la corteza. A continuación, cortar el cráneo desde la base hasta la nariz (a lo largo de la sutura sagital), retirar con cuidado el hueso parietal suave tirando de cada hemisferio a un lado y quitar la corteza con una espátula. Inserte la espátula en el cerebro por encima del cerebelo y luego saca la corteza y lo coloca en tampón helado GM. Proceder de inmediato a la etapa de homogeneización. No deje que la corteza se sientan en tampón helado por mucho tiempo ya que esto afectará negativamente a la formación de los ganglios centinela.

3. Preparación de homogeneizado y el SNS 4.1

  1. Enjuague las cortezas de helado de amortiguación de GM y la transferencia de dos cortezas de un vaso Dounce homogeneizadora que contiene 5 ml de tampón enfriado GM.
  2. Homogeneizado con cuidado la corteza con movimientos 5-10 de la mano del mortero suelto (maja "A"), seguido por los golpes de la mano del mortero 5.10 ajustado (mortero "B"). Movimientos deben ser rápidos, pero lo suficientemente lento como para no provocar burbujas de aire. Una imagen de la homogeneizado después de la homogeneización es en el esquema 1. El número de golpes pueden variar depende de la persona homogeneizador y manos que acompañan. Cuando termine los gradientes debe dar una fuerte banda de SN, en caso contrario, ajustar el número de golpes.
  3. Transferir el homogeneizado a una cónica de 15 ml y centrifugar a 1000xg durante 10 min a 4 ° C en un rotor basculante (Allegra 6KR centrífuga) para sedimentar los desechos celulares y los núcleos. Una imagen de la homogeneizado hilar es en el esquema 1.
  4. Capa de 2 ml del sobrenadante por gradiente de Percoll-sacarosa, la tapa de los tubos, y se centrifuga a 32.500 xg durante 5 min a 4 ° C en un rotor de ángulo fijo (Beckman J2-21 centrifugadoras, JA-17 rotor) con los adaptadores adecuados ( Ver Tabla Reactivos y Equipos).
  5. Pipeta y deseche la solución por encima de la banda de SN con una pipeta Pasteur de vidrio. Pipeta de la banda de SN en la interfaz% 15/23, traslado a una cónica y almacenar en el hielo. Cada gradiente o la corteza produce un 0,9-1,1 ml de SN.
  6. Ajustar la concentración de sal en el SNS mediante la adición de una décima parte del volumen de tampón de estimulación 10x, 1000x añadir CaCl2 a una concentración final de 12 nM, y añadir 1 mM de archivo TTX a una concentración final de 1 M para suprimir la excitación inespecífica. (La adición de CaCl 2 es opcional si se va a interferir con posteriores aplicaciones de SN).
  7. Determinar la concentración de proteínas del SNS con el Micro BCA Protein Kit de ensayo. (El ensayo de proteínas Bradford no se recomienda debido a la inferencia de la Percoll.)
  8. SNS puede ser utilizado directamente y con rapidez para la proteína traducciónción los estudios. Para otras aplicaciones SN lisado puede ser limpiado o se concentra con el Pierce SDS-PAGE de muestras Kit de preparación.

4. Los resultados representativos:

Cuando el ratón corteza se homogeneizó y se separó en sacarosa discontinua de Percoll-gradientes (Esquema 1), 6 bandas o fracciones se observaron (Figura 1). Se ha demostrado previamente para la corteza cerebral de rata 3,5 que los componentes de las bandas de alto peso molecular se rompe la membrana y de la mielina y que el material granulado contiene mitocondrias u orgánulos (Tabla 1). El 23% / 15% de la interfaz (banda 5) que figuran el SNS enriquecido.

La banda en el 23% / 15% de la interfaz, que contiene SN intacto, se extrae y se examina por microscopía electrónica (EM) como se describió anteriormente. 2,6 EM mostró la presencia de vesículas sinápticas intacta y la preservación de los elementos presinápticos y postsinápticos (Figura 2). El aislamiento de los compartimentos de pre-y post-sinápticas es importante para el examen de la señalización y la síntesis de proteínas, que se produce en ambos compartimientos. 13.7 El gradiente de Percoll-sacarosa es una purificación del crudo por lo que vimos menor contaminación celular, nuclear y orgánulos en la fracción de SN, pero la separación en general era buena.

Cuando se examina por Western blot, las fracciones de Percoll contenía los marcadores de proteínas se espera un aumento en la pureza sináptica en la banda de SN (Figura 3, Tabla 2). Marcadores sinápticos y neuronales se mantuvieron en la banda enriquecido SN (banda 5), ​​pero la abundancia de otros marcadores se redujo significativamente. En particular, la presencia de GFAP, un marcador para las células de astrocitos y neoplásicas de origen glial, y Lamin-B1, un marcador nuclear, eran insignificantes, si bien los indicadores estructurales y sináptica se han mantenido o mejorado. Además, hubo retención de los marcadores de orgánulos, como las mitocondrias y Golgi, que desempeñan un papel en la síntesis de proteínas.

Los rendimientos típicos para la banda de 250-500 ng SN fueron de proteína por microlitro, según lo determinado por el ensayo de proteína BCA. La actividad del SNS se determina por la cantidad de la síntesis de proteínas de novo presentan como la supervisión de [35S]-Met incorporación (Figura 4). 2 la actividad basal de traslación se incrementó 1.56 veces cuando fueron estimulados con SN 50 M glutamate/10 M glicina (Glu) o 5,12 veces cuando se activa con el inhibidor de la juglone Pin1. Inhibición Pin1 es sabido que resulta en la síntesis de proteínas. 2 Para confirmar que el aumento de [35S]-Met incorporación fue debido a la síntesis de novo de proteínas, hemos añadido 40 anisomicina M, un inhibidor de la síntesis de proteínas, y vio una marcada disminución en la incorporación en presencia y ausencia de Glu en comparación con los niveles basales. Además, en la adición de 2% Triton X-100, que altera la integridad del Sistema Nacional de Salud, la traducción basal se redujo en un 75%. 2 Además, al examinar las bandas (B4-B6), que mostró el enriquecimiento marcador más sináptica, El SNS o Banda 5 tuvo la mayor actividad para la síntesis de proteínas de novo (Figura 5). Así, la sacarosa discontinua de Percoll-gradientes rápidamente una gran actividad y enriquecido banda SN que se pueden utilizar para estudiar la traducción de proteínas.

Lo discontinuo de Percoll-sacarosa procedimiento pendiente es más ventajosa que otros métodos, porque el daño mecánico es causado por condiciones más duras. En comparación con el método de filtración, en la que aclaró homogeneizado cortical pasa a través de una serie de filtros que disminuyen de tamaño, el método de Percoll 3,14-15 formas más ganglios centinela, con una mayor actividad. Como se observa en la Figura 6, cuando una parte alícuota del SNS elaborado por el método de filtración fue pasado por un gradiente de Percoll-sacarosa hay ganglios centinela mucho menos en la interfaz% 15/23 y una mayor cantidad de membranas rotas. Cuando la síntesis de novo de proteínas se midió a través de la incorporación S35-se reunió, el ​​SNS elaborado por el método de filtración son mucho menos activas (Figura 7). Para maximizar la actividad de traducción que utilizamos ratones que son entre las edades de P14 y P18. SN puede ser preparado a partir de ratones adultos, pero se observó una actividad significativamente mayor traslación con SN preparado a partir de ratones jóvenes (Figura 8).

Diagrama de tabla de componentes celulares que detalla la distribución de membranas, mielina, SN y orgánulos.
Tabla 1. Componentes de las bandas de la discontinua gradiente de Percoll-fraccionamientos de la corteza cerebral del ratón homogeneizado. 3,5

Tabla de expresión de marcadores proteicos; Análisis comparativo de bandas con marcadores de estructuras celulares.
Tabla 2. Resumen del análisis de perno occidental de sacarosa discontinua de Percoll-componentes gradiente de banda. Concentraciones relativas de proteína para cada una de las fracciones de banda aislada con un Percol discontinual-gradiente de sacarosa se determinó por Western blot. Sin presencia de proteínas (-), 0 ≥ 0,2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), o> 0,8 veces (+++) = más de proteína presente en el representante sobrenadante (S, se centrifuga la corteza homogeneizado), de n 3.

Disección de corteza, homogeneización en tampón, centrifugación en gradiente, proceso de aislamiento de banda SN.
Esquema 1: Esquema de una preparación de SN con una discontinua de Percoll-sacarosa gradiente de densidad de corteza de cerebro de ratón se disecaron, se homogeneiza y se centrifuga a baja velocidad para eliminar no homogeneizado de tejidos, células, orgánulos enteros, como los núcleos y las membranas.. El gradiente discontinuo debe tener claramente definidas las capas. La imagen insertada se muestra un ejemplo de las capas, que se han teñido de azul para fines ilustrativos con el fin de visualizar las capas. El sobrenadante se coloca sobre la parte superior de una discontinua de Percoll-gradiente de sacarosa y se centrifuga a una velocidad media. La banda de SN se recupera de la pendiente y está listo para usar.

Centrifugación en gradiente de densidad de equilibrio, diagrama con bandas de gradiente para el análisis de separación de proteínas
Figura 1. Fraccionamiento homogeneizado en una discontinua de Percoll-gradiente de sacarosa. Ratón corteza se homogeneizó y se separó en forma discontinua de Percoll-sacarosa gradiente que da lugar a seis bandas o fracciones. El purificado, activo SN (*) se encontraron en la banda 5.

Imagen de microscopía electrónica de transmisión, orgánulos celulares con flechas rojas, análisis de estructura celular.
Figura 2. Preparaciones SN dar una mezcla heterogénea de GC que retienen los elementos presinápticos y postsinápticos. Una micrografía electrónica de una preparación de SN preparado a partir de ratones C57BL / 6 (edad P13 a P21) se realizó como se describió anteriormente y se muestra con SN conserva elementos presinápticos y postsinápticos. 2 , 6 puntos flechas rojas a la post-sináptica densidades. Barra de escala es de 1 micras.

Resultados de Western blot que muestran la expresión proteica de β-actina, GFAP, SNAP25; bandas 1-6, S.
Figura 3. Análisis de Western blot de los preparativos SN mostraron que los marcadores sinápticos y neuronales se mantuvieron en el SNS purificada (banda 5), pero la abundancia de otros marcadores se redujo significativamente. Inmunotransferencias de sobrenadante (S, se centrifuga homogeneizado cortical) y las bandas 1-6 de forma discontinua Percoll-gradiente de sacarosa se probaron para β-actina (control estructural, carga), GFAP (astrocitos), GP73 (Golgi), HSC70 (citoplasmática y nuclear), Lamin-B1 (nuclear), la prohibitina (mitocondrial), PSD95 (densidad postsináptica ), SNAP25 (sinapsis), sinaptofisina (sináptica) y β3-tubulina (neuronal específica). Las bandas se visualizaron con una tormenta de 860 PhosphorImager, representante de n = 3.

Electroforesis de proteínas y tabla de incorporación de S35-Met; análisis de los efectos Glu, Aniso.
Figura 4. GC se activa y muestra la síntesis de proteínas de novo a través de [35S]-Met incorporación. SNs se pre-equilibrio a 37 ° C durante 10 min. A continuación, el SNS no fueron tratadas o tratadas previamente durante 15 minutos con anisomicina M 40 o un juglone M a 37 ° C seguido por la adición de [35S]-Met, 20 l expreso Pro Label Mix S35 etiquetas de uso sencillo, más o menos Glu a 37 ° C durante 30 minutos. Las muestras se prepararon utilizando el Pierce SDS-PAGE de muestras Kit de preparación, se ejecutan en un gel de poliacrilamida al 15%, se seca y se cuantificaron utilizando una dinámica molecular Tormenta 860 PhosphorImager, representante de n = 3, ± SEM.

Electroforesis en gel y gráfico de barras que compara los niveles de incorporación de proteínas; muestra los datos del S35-Met.
Figura 5. Banda de 5 a partir de lo discontinuo de Percoll-gradiente de sacarosa contenía los niveles más altos de la síntesis de proteínas de novo. Las bandas 4, 5 y 6 y el sobrenadante (S, se centrifuga homogeneizado cortical) se pre-equilibrio a 37 ° C durante 10 min. Entonces, [35S]-Met, Express Mix Pro Label S35 etiquetas de uso sencillo, se añadió, más o menos Glu a 37 ° C durante 30 min. Las muestras se prepararon utilizando el Pierce SDS-PAGE de muestras Kit de preparación, se ejecutan en un gel de poliacrilamida al 15%, se seca y se cuantificaron utilizando una dinámica molecular Tormenta 860 PhosphorImager, representante de n = 3, ± SEM.

Purificación de proteínas, tubos de formación de sedimentos, comparación de resultados experimentales.
Figura 6. SN preparado a partir de un método de filtración contienen membranas más roto y el SNS menos que todo SN preparado por el método del gradiente discontinuo de Percoll-sacarosa. GC fueron preparados por pasar a través de la corteza homogeneizado una serie de filtros con la disminución de tamaño de poro como se describió anteriormente. 3,14-15 una alícuota del SNS elaborado por el método de filtración se centrifugó durante un discontinuo de Percoll-gradiente de sacarosa y se compara con una cantidad equivalente de material con el discontinuo de Percoll-sacarosa método del gradiente.

gráfico de barras y gel SDS-PAGE de la incorporación de S35-Met; análisis de proteínas, resultados experimentales.
Figura 7. SN preparado a partir de un método de filtración contienen menos proteínas de novo actividad de síntesis de SN preparado aquí para allám lo discontinuo de Percoll-sacarosa método del gradiente. GC fueron preparados por pasar a través de la corteza homogeneizado de una serie de filtros con poros de tamaño cada vez menor como se describió anteriormente, 3,14-15 y por los métodos de gradiente discontinuo de Percoll-sacarosa. SN de ambas preparaciones se pre-equilibrio a 37 ° C durante 10 min. Entonces, [35S]-Met, Express Mix Pro Label S35 etiquetas de uso sencillo, se añadió, más o menos Glu a 37 ° C durante 30 min. Las muestras se prepararon utilizando el Pierce SDS-PAGE de muestras Kit de preparación, se ejecutan en un gel de poliacrilamida al 15%, se seca y se cuantificaron utilizando una dinámica molecular Tormenta 860 PhosphorImager, representante de n = 3, ± SEM.

Gráfico de barras y gel SDS-PAGE que muestra la incorporación de S35-Met en muestras de proteínas bajo control y condiciones de glucosa.
Figura 8. SN de ratones más jóvenes (P14) tienen una mayor actividad de traslación de los ratones más viejos (P85). Ganglios centinela fueron preparados a partir de diferentes ratones de edad avanzada con el discontinuo de Percoll-sacarosa método del gradiente, preequilibrated a 37 ° C durante 10 minutos, tratados o no con Glu en la presencia de [35S]-Met (Express Pro Label Mix S35 etiquetas de uso sencillo) durante 30 minutos, se congelaron, y luego limpiarse con el Pierce SDS-PAGE Kit preparación de muestras. El SNS se ejecuta sobre un 12% SDS-gel de poliacrilamida, secado y la imagen de una tormenta de dinámica molecular 860 PhosphorImager, representante de n = 3, ± SEM. SN de los ratones P14 por lo menos tres veces más activos que los ratones P85.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo discontinuo de Percoll-sacarosa gradiente de preparación descrito en este documento es un método rápido y fiable para aislar activos del SNS, que se puede utilizar en una variedad de experimentos de transmisión sináptica. Este método del gradiente, que se basa en el método desarrollado por Dunkley et al. 3,4, es un procedimiento de fraccionamiento subcelular cerebro que aísla tanto de pre-y post-sinápticas derivados vesículas de membrana que se asocian unas con otras. Sin más purificación estos ganglios ce...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría agradecer a BK agosto en la Universidad de Wisconsin-Madison Fondo microscopio electrónico para la microscopía electrónica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R01-DA026067 y P30 HD03352 (a JSM).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios (opcional)
Micro BCA Protein Kit de ensayo Atravesar 23235
CaCl2 Pescador C79-500
CO 2 gas Airgas (UW-MDS) CD 50
EDTA RPI E57020
EtOH Pescador A407SK-4
HCl Pescador A142-212
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
KH 2 PO 4 Pescador P285-500
PierceSDS-PAGE preparación de muestras Kit Atravesar 89888
NaCl RPI S23020
NaHCO3 Pescador BP328-500
Na 2 PHO 4 Pescador S381-500
Sacarosa RPI S24060
Tris Base RPI T60040
Tetrodotoxina Sigma T5651
Expresa Pro Label Mix S35 etiquetas de uso sencillo Perkin Elmer NEG772
Equipo Empresa Número de catálogo Comentarios (opcional)
Herramientas de disección
Dounce homogeneizadora, 7 ml (viene con dos morteros de vidrio tipo "A" y "B") Wheaton
P1000 Gilson Pipetman Gilson F123602
Allegra 6KR centrífuga Beckman Coulter 366830
GH 3.8 del rotor, el rotor basculante Beckman Coulter 360581
Beckman J2-21 Centrífuga Beckman
Beckman tubos con tapas Beckman 355672
Blancas paredes de adaptadores Beckman 342327
Azul adaptadores de pared Beckman
JA-17 Rotor, Rotor de ángulo fijo Beckman 369691

Tabla de los anticuerpos utilizados para western blots:

Nombre de anticuerpos Empresa Número de catálogo Especie huésped Factor de dilución
β-actina Sigma A5441 ratón 1:2000
GFAP Santa Cruz sc-65343 ratón 1:200
GP73 Santa Cruz Sc-134509 conejo 1:200
HSC70 Santa Cruz sc-7298 ratón 1:200
Laminβ Santa Cruz SC-6261 cabra 1:200
Prohibitina Santa Cruz sc-28259 conejo 1:200
PSD95 Millipore MAB1596 ratón 5 g / l
SNAP25 AbCam ab5666-100 conejo 1:2000
Sinaptofisina Millipore MAB368 ratón 1:500
β-3-tubulina Santa Cruz sc-80016 ratón 1:200

References

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