Method Article

Preparación de Synaptoneurosomes de ratón con una corteza discontinua de Percoll-sacarosa gradiente de densidad

DOI:

10.3791/3196

⸱

September 17th, 2011

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin, 2Department of Biochemistry, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin

In This Article

Summary

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Un método para preparar translationally activa, synaptoneurosomes intacta (SN) de la corteza cerebral del ratón se describe. El método utiliza una discontinua de Percoll-sacarosa gradiente de densidad que permite la rápida preparación de los ganglios centinela activa.

Abstract

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Synaptoneurosomes (SN) se obtienen después de la homogeneización y fraccionamiento de la corteza cerebral del ratón. Que se hara vesículas o terminales aislados que rompen con terminales de los axones en el tejido cortical se homogeneiza. El SNS conservar las características pre-y post-sináptica, lo que hace que sean útiles en el estudio de la transmisión sináptica. Conservan la maquinaria molecular utilizados en la señalización neuronal y que son capaces de captación, almacenamiento y liberación de neurotransmisores.

La producción y el aislamiento de ganglios centinela activa puede ser problemático, utilizando como medios de Ficoll, que pueden ser citotóxicos y requieren centrifugación extendido debido a la alta densidad, y la filtración y el método de centrifugado, que puede resultar en una baja actividad debido a los daños mecánicos del SNS. Sin embargo, el uso de gradientes de densidad de sacarosa discontinua de Percoll para aislar SN proporciona un método rápido para producir un buen rendimiento del SNS translationally activo. El método del gradiente de Percoll-sacarosa es rápida y suave, ya que emplea a condiciones isotónicas, tiene menos y más cortas tiradas centrifugación y evita pasos de centrifugación que la SNS pellet y causar daños mecánicos.

Protocol

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1. Preparativos 4.1

  1. Preparar 500 mL de tampón de gradiente medio (GM) al mezclar 50 ml de una suspensión de sacarosa 2,5 M, 2,5 ml de 1M Tris-HCl, pH 7,5 acciones, y 0,1 mL de EDTA 0,5 M, pH 8,0 con valores de mili- Q agua a volumen. Filtro de esterilización de la solución, alícuota y almacenar congelado.
  2. Preparar un stock de 1.000 veces la tetrodotoxina (TTX), haciendo una solución 1 mM en mili-Q H 2 O. Alícuotas de TTX se pueden almacenar a -20 ° C.
  3. Prepare el buffer de la estimulación de 10x por lo que una solución de 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM KH 2 PO 4,

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Discussion

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Lo discontinuo de Percoll-sacarosa gradiente de preparación descrito en este documento es un método rápido y fiable para aislar activos del SNS, que se puede utilizar en una variedad de experimentos de transmisión sináptica. Este método del gradiente, que se basa en el método desarrollado por Dunkley et al. 3,4, es un procedimiento de fraccionamiento subcelular cerebro que aísla tanto de pre-y post-sinápticas derivados vesículas de membrana que se asocian unas con otras. Sin más purificación estos ganglios ce.......

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Disclosures

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No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

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Nos gustaría agradecer a BK agosto en la Universidad de Wisconsin-Madison Fondo microscopio electrónico para la microscopía electrónica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R01-DA026067 y P30 HD03352 (a JSM).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios (opcional)
Micro BCA Protein Kit de ensayo Atravesar 23235
CaCl2 Pescador C79-500
CO 2 gas Airgas (UW-MDS) CD 50
EDTA RPI E57020
EtOH Pescador A407SK-4
HCl Pescador A142-212
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
KH 2 PO 4 Pescador P285-500
PierceSDS-PAGE preparación de muestras Kit Atravesar 89888
NaCl RPI S23020
NaHCO3 Pescador BP328-500
Na 2 PHO 4 Pescador S381-500
Sacarosa RPI S24060
Tris Base RPI T60040
Tetrodotoxina Sigma T5651
Expresa Pro Label Mix S35 etiquetas de uso sencillo Perkin Elmer NEG772
Equipo Empresa Número de catálogo Comentarios (opcional)
Herramientas de disección
Dounce homogeneizadora, 7 ml (viene con dos morteros de vidrio tipo "A" y "B") Wheaton
P1000 Gilson Pipetman Gilson F123602
Allegra 6KR centrífuga Beckman Coulter 366830
GH 3.8 del rotor, el rotor basculante Beckman Coulter 360581
Beckman J2-21 Centrífuga Beckman
Beckman tubos con tapas Beckman 355672
Blancas paredes de adaptadores Beckman 342327
Azul adaptadores de pared Beckman
JA-17 Rotor, Rotor de ángulo fijo Beckman 369691

Tabla de los anticuerpos utilizados para western blots:

Nombre de anticuerpos Empresa Número de catálogo Especie huésped Factor de dilución
β-actina Sigma A5441 ratón 1:2000
GFAP Santa Cruz sc-65343 ratón 1:200
GP73 Santa Cruz Sc-134509 conejo 1:200
HSC70 Santa Cruz sc-7298 ratón 1:200
Laminβ Santa Cruz SC-6261 cabra 1:200
Prohibitina Santa Cruz sc-28259 conejo 1:200
PSD95 Millipore MAB1596 ratón 5 g / l
SNAP25 AbCam ab5666-100 conejo 1:2000
Sinaptofisina Millipore MAB368 ratón 1:500
β-3-tubulina Santa Cruz sc-80016 ratón 1:200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
  2. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic pr....

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SynaptoneurosomesMouse CortexPercoll Sucrose GradientDensity Gradient CentrifugationSynaptosome IsolationWestern Blot AnalysisS35 Methionine IncorporationProtein Translation StudiesSynaptic Vesicle UptakeNeurotransmitter Release

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