Trasplante transnasal de células microgliales humanas derivadas de células madre pluripotentes inducidas en el cerebro del ratón

Resumen

Fuente: Parajuli, B., et.al. Trasplante de microglía derivada de células madre pluripotentes inducidas por humanos en cerebro de ratones inmunocompetentes por vía transnasal no invasiva. J. Vis. Exp. (2022).

Este video demuestra el trasplante transnasal de células de microglía humana derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSMG) en un cerebro de ratón. La hialuronidasa se aplica a las fosas nasales de un ratón con agotamiento microglial para mejorar la permeabilidad. La suspensión de iPSMG se administra por vía intranasal y se permite que el ratón se recupere. Los medios ricos en factores de crecimiento se administran regularmente para apoyar la supervivencia de iPSMG en el tejido cerebral.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación del medio celular, medio de trasplante y mezcla de anestesia

1. Prepare el medio celular agregando un 10% de suero bovino fetal y un 0,1% de penicilina/estreptomicina en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco.
2. Prepare el medio de trasplante agregando factor estimulante de colonias humanas 1 o hCSF1 (250 ng / ml) y factor de crecimiento transformante humano beta 1 o hTGF-β1 (100 ng / ml) al medio celular.
3. Prepare la mezcla de anestesia para inyección intraperitoneal mezclando 0,45 ml de clorhidrato de medetomidina, 1,2 ml de midazolam y 1,5 ml de tartrato de butorfanol en 11,8 ml de solución salina normal.

2. Preparación de células de microglía humana derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSMG)

NOTA: El iPSMG congelado (tabla de materiales) se mantuvo a -80 °C hasta su uso.

1. Descongele las células congeladas rápidamente en un baño de agua a 37 °C. Agite las muestras hasta que todo el hielo visible se haya derretido.
2. Añadir la microglía humana derivada de células madre pluripotentes inducidas descongeladas (iPSMG) al medio de cultivo calentado a 37 °C. Añadir 1 ml de células descongeladas que contengan medio (1 × 10⁶ células) a 10 ml del medio de cultivo.
3. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min para obtener un pellet celular.
4. Después de la centrifugación, elimine todo el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. Es deseable la eliminación completa del sobrenadante para reducir la dilución de la concentración de citoquinas en el medio de trasplante.
5. Agregue el medio de trasplante para obtener una concentración celular de 1 x 10⁵ células/μL.
6. Coloque el iPSMG en hielo e inmediatamente proceda al trasplante.
   NOTA: La preparación de iPSMG para trasplante se realiza en un banco limpio para evitar la contaminación.

3. Preparación del ratón para trasplante transnasal (Tsn)

1. Alimente a los ratones machos de tipo salvaje (C57BL / 6J, 8 semanas de edad) con una dieta que contenga PLX5622 durante 7 días.
2. Al final del^7º día, suspender la dieta PLX y alimentar a los ratones con una dieta normal hasta el final del estudio.
   NOTA: PLX5622 dieta que contiene se prepara añadiendo 1,2 g de PLX5622 en 1 kg de AIN-93G (Tabla de materiales).

4. Trasplante transnasal de células

1. 24 h después del cese de la alimentación con PLX, pesar los ratones y anestesiarlos mediante una inyección intraperitoneal de la mezcla de anestesia (0,2 mL/20 g).
2. Después de que los ratones estén completamente anestesiados según lo evaluado por la falta de respuesta al reflejo de retirada del pedal (pellizco firme del dedo del pie), administre 2,5 μL de hialuronidasa en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (100 U / mL), 1 h antes del trasplante transnasal de iPSMG a cada fosa nasal dos veces usando una punta de pipeta de 10 μL para aumentar la permeabilidad de la mucosa nasal.
3. Después de la aplicación de hialuronidasa, coloque a los ratones en posición supina.
4. Repita el paso 4.2 10 min antes del trasplante transnasal de iPSMG.
5. Aplique 2,5 μl de suspensión celular en una fosa nasal del ratón con una punta de pipeta de 10 μl.
6. Coloque el ratón en posición supina durante 5 min antes de administrar la suspensión celular a la otra fosa nasal.
7. Repita los pasos 4.5 y 4.6 cuatro veces, aplicando un volumen total de 20 μL por animal.
8. Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla térmica a 37 °C hasta que se recupere de la anestesia.
9. A las 48 h después del cese de la alimentación con PLX, repita los pasos 4.1-4.7 en los mismos ratones una vez más.
   NOTA: Cabe señalar que las células iPSMG se colocan en hielo durante el trasplante.

5. Aplicación de citoquinas

1. Anestesiar a los ratones mediante una inyección intraperitoneal de mezcla de anestesia (0,2 mL/20 g).
2. Aplique 2,5 μl del medio de trasplante en una fosa nasal del ratón con una punta de pipeta de 10 μl.
3. Coloque el ratón en posición supina durante 5 min antes de administrar el medio de trasplante en la otra fosa nasal.
4. Repita los pasos 5.2 y 5.3 cuatro veces, aplicando un volumen total de 20 μL por animal.
   NOTA: Cabe señalar que se requiere la administración transnasal de medio de trasplante (citoquinas humanas) cada 12 h para la viabilidad del iPSMG trasplantado hasta el final del estudio.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	10566
AIN 93G	Oriental Yeast Co
Suero fetal bovino	GE Healthcare Life Sciences	SH30070.03
Frozen iPSMG	Shionogi & Co., Ltd		Laboratorio para el Descubrimiento de Fármacos e Investigación
de Enfermedades Factor estimulante de colonias humanas 1 (hCSF1)	PeproTech	300-25
Hialuronidasa	Sigma-Aldrich	H-3506
Clorhidrato de medetomidina	Meiji Seika	VETLI5
Midazolam	Astellas	18005A2
Paraformaldehído	Wako Pure Chemical Industries	162-16065
Penicilina/estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Pipeta	Eppendorf	3120000011
Punta de pipeta	Eppendorf	30076028
PLX5622	Amadis Factor de	crecimiento
químico-β1 (Tgf-b1)	PeproTech	100-21

transformante A930097