Este protocolo describe la forma de cuantificar el Mg (II)-dependiente de la formación de la estructura del ARN superior mediante dos métodos de huella radical hidroxilo.
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Artículo de método
Seguimiento de los cambios de equilibrio en la estructura del ARN por "peroxidación" y "oxidativo" Huella de radicales hidroxilo
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Las moléculas de ARN desempeñan un papel esencial en la biología. Además de transmitir la información genética, el ARN puede plegarse en estructuras terciarias única que cumple un papel biológico específico, como regulador, carpeta o un catalizador. Información acerca de la formación terciaria de contacto es esencial para entender la función de moléculas de ARN. Radicales hidroxilo (OH •) son las sondas único de la estructura de los ácidos nucleicos, debido a su alta reactividad y tamaño pequeño. 1 Cuando se utiliza como una sonda de huellas, los radicales hidroxilo mapa de la superficie accesible al soluto de la columna vertebral fosfodiéster del ADN y el ARN 1 2 con tan fina como la resolución de un solo nucleótido. La huella radical hidroxilo se puede utilizar para identificar los nucleótidos dentro de una superficie de contacto intermolecular, por ejemplo, en el ADN en proteínas y complejos de un ARN-proteína. Equilibrio 3 y 4 cinética transiciones se puede determinar mediante la realización de la huella de radicales hidroxilo en función de un solutien la variable o la hora, respectivamente. Una característica clave de la huella es que la exposición limitada a la sonda (por ejemplo, "un solo ataque cinética") se traduce en la toma de muestras uniformes de cada nucleótido del polímero. 5
En este artículo, video, utilizar el dominio P4-P6 de la ribozima de Tetrahymena para ilustrar la preparación de ARN de la muestra y la determinación de Mg (II) mediada por las isotermas de plegado. Se describe la utilización del conocido protocolo de hidroxilo huella radical que requiere de H 2 O 2 (a esto lo llamamos el "peroxidación" protocolo) y un valor, pero no se conoce ampliamente, alternativa que utiliza naturalmente, O 2 disuelto (llamamos a esto "el oxidativo "protocolo). Una visión general de la reducción de datos, la transformación y los procedimientos de análisis se presenta.
Protocolo
1. Preparación de los reactivos Huella
- Preparar un tampón de reacción 10x con 100 mM cacodilato de sodio, 1 mM EDTA y 1 M KCl. Ajustar el pH a 7.4. Filtro de la memoria intermedia con un 0,2 M de acetato de dispositivo de filtro (Nalgene). Nota: no ARN pipeta directamente en el buffer 10x.
- Prepare la mezcla de reacción de titulación para cada reacción, como se indica en la Tabla 1. El volumen de la mezcla de la valoración (1x buffer y Mg (II) a la concentración deseada) debe ser de 90 l, antes de añadir 10μl de ARN en tampón 1x.
- Preparar un buffer de RNasa T1 digestión que contiene urea 6.63M, citrato de sodio 20 mM, 1 mM EDTA, 0,25 mg ....
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Discusión
La huella radical hidroxilo es una herramienta valiosa para evaluar el área de superficie accesible disolvente de los ácidos nucleicos. Formación cualitativa y cuantitativa de la estructura terciaria 14 se puede seguir en función de parámetros como el tipo de iones y la concentración, pH, temperatura, proteínas de unión o plegamiento factores de co-. La atractiva combinación de un protocolo sencillo y de bajo costo y la accesibilidad resulta solvente y la información de plegado en un nivel de nucleótido único.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud-SR1 GM085130 y National Science Foundation MCB0929394. Agradecemos a la Dra. Marion Schmidt por su hospitalidad y por permitirnos filmar en su laboratorio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre | Empresa | N.º de catálogo | |
| Cacodilato sódico (¡Precaución! Tóxico) | Sigma-Aldrich | C4945-25g | |
| EDTA (0,5 M) | Ambion | AM9260G | |
| Agua tratada con DEPC | Ambion | AM9915G | |
| Acetato sódico (3 M) | Ambion | AM9740 | |
| MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G | |
| Urea | Ambion | AM9902 | |
| Citrato sódico | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | R-7876 | |
| L-ascorbato sódico | Sigma-Aldrich | A7631-25g | |
| Fe(NH4)2(SO4)2 · 6 H2O | Sigma-Aldrich | F1543-500g | |
| RNasa T1 | Fermentas | EN0541 | |
| Peróxido de hidrógeno (30 %) | Sigma-Aldrich | 349887 |
Referencias
- Tullius, T. D., Dombroski, B. A. Hydroxyl radical "footprinting": high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).
- Celander, D. W., Cech, T. R.
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