Retardada de hipersensibilidad (DTH) es una reacción inflamatoria mediada por CCR7-T de memoria efectora (TEM) de linfocitos. Aquí se demuestra cómo activar antígenos específicos de células TEM, inducir DTH adoptivos en ratas Lewis y controlar la respuesta inflamatoria.
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Artículo de método
Inducción y Seguimiento de Adopción de hipersensibilidad retardada en ratas
En este artículo
Resumen
Resumen
Retardada de hipersensibilidad (DTH) es una reacción inflamatoria mediada por CCR7-efector linfocitos T de memoria que se infiltran en el sitio de la inyección de un antígeno contra el que ha sido el sistema inmunológico preparado. La reacción inflamatoria se caracteriza por enrojecimiento e inflamación del sitio de estímulos antigénicos. Es un modelo práctico para determinar la eficacia in vivo de los inmunosupresores. DTH cutánea puede ser inducido, ya sea por transferencia adoptiva de linfocitos T antígeno-específicos o mediante la inmunización activa con un antígeno, y el desafío posterior intradérmica con el antígeno para inducir la reacción inflamatoria en la piel de una zona determinada. Respuestas DTH pueden ser inducidas a diversos antígenos, para la ovoalbúmina ejemplo, la tuberculina, toxoide tetánico, o hemocianina de lapa californiana. Estas reacciones también pueden ser inducidos en contra de autoantígenos, por ejemplo, proteína básica de mielina (MBP) en ratas con encefalomielitis autoinmune experimental inducida con MBP, un modelo animal de esclerosis múltiple (1). Aquí se demuestra la forma de inducir una reacción adoptivos DTH en ratas Lewis. En primer lugar, se estimula la ovoalbúmina específicos de las células T in vitro y se inyecta por vía intraperitoneal estas células activadas a las ratas ingenuo. Después de permitir que las células que se equilibre en vivo durante 2 días, le desafío a las ratas con ovoalbúmina en el pabellón de una oreja, mientras que el otro oído Wil reciben solución salina. La reacción inflamatoria será visible 3-72 horas más tarde y espesor de la oreja se medirá como una indicación de la gravedad de DTH.
Protocolo
1. La estimulación de los linfocitos T específicos ovoalbúmina
Descanso específicos ovoalbúmina las células T son estimulados con ovoalbúmina en la presencia de ratas Lewis timocitos irradiados (30 Gy) como células presentadoras de antígeno (APC), en medio de estimulación (Preparar en DMEM + penicilina / estreptomicina / L + GLUT-AANE RPMI + Vitaminas + + 2ME suero de rata + ovoalbúmina, a las concentraciones finales se señala en la lista de materiales.)
Suero de rata preparación
- Tomamos el suero de las ratas que el sacrificio como donantes timo.
- Las ratas son profundamente anestesiados por i....
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Discusión
El desafío antigénico también se puede realizar en otros sitios, por ejemplo en la piel de la espalda (2). Sin embargo nos encontramos que un reto. Usando el pabellón de la oreja, como se muestra en este video, permite la medición más precisa de la reacción de DTH.
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Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Alexander Flugel (Martinsried, Alemania) para darnos la GFP-etiquetados, ovoalbúmina línea de células T específicas utilizadas en este protocolo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | GIBCO, por Life Technologies | 12430-062 | 500 ml |
| Piruvato de sodio | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM final, en medio de estimulación |
| Penicilina – Estreptomicina – L-Glutamina | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectivamente, final, en medio de estimulación |
| Aminoácidos no esenciales | Sigma-Aldrich | R7131 | NEAA, 1% final, en medio de estimulación |
| Vitaminas RPMI | Sigma-Aldrich | R7256 | 1% final, en medio de estimulación |
| Beta-mercapto–etanol | Sigma-Aldrich | M6250 | 2ME, 50 μM final, en medio de estimulación |
| Suero de rata síngeo | 1% final. Véase explicación en el Protocolo. | ||
| Ovoalbúmina | Sigma-Aldrich | A5503 | 10 μg/ml final, en medio de estimulación. |
Referencias
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. , 166-936 (2001).
- Beeton, C., Chandy, K. G.
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Reimpresiones y permisos
