Una basada en PCR genotipificación método para distinguir entre las variedades de tipo silvestre y ornamental de Imperata cylindrica</em

Resumen

Ofrecemos un protocolo de genotipificación molecular de costo-efectiva y rápida que emplea a gran específicos-PCR que se dirigen a diferencias en las secuencias de ADN dentro de la región del cloroplasto espaciador trnL-F para diferenciar entre las variedades de Imperata cylindrica (Plantas de cogongrass tengan) que no se pueden distinguir por morfología solo. Estas variedades incluyen la maleza nociva en la lista federal, plantas de cogongrass tengan y estrechamente relacionada, extendida variedad ornamental, que. cylindrica Var. Koenigii (Hierba sangre japonesa).

Resumen

Wild-tipo I. cylindrica (plantas de cogongrass tengan) es uno de los diez peores plantas invasoras en el mundo, afectando negativamente a los recursos agrícolas y naturales en 73 países diferentes de África, Asia, Europa, Nueva Zelanda, Oceanía y las Américas, ^1-2. Cogongrass forma rápida propagación-, stands monodominantes que desplazan a una gran variedad de especies de plantas nativas y, a su vez amenazan a los animales nativos que dependen de las especies de plantas nativas desplazadas para el forraje y refugio. Para agravar el problema, una variedad ornamental [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] es ampliamente comercializado bajo el nombre de 'Rubra' Imperata cylindrica, Barón Rojo, y la hierba la sangre japonesa (JBG). Esta variedad es supuestamente estéril y no invasiva y es considerado como una planta ornamental deseable para sus hojas de color rojo. Sin embargo, en las condiciones correctas, la JBG se puede producir semillas viables (Carol Holko, 2009 comunicación personal) y puede volver a una zona verde invasive forma que es a menudo indistinguibles de plantas de cogongrass tengan, ya que toma las características distintivas de la variedad invasivo de tipo salvaje ⁴ (Figura 1). Esto hace que la identificación con la morfología de una tarea difícil, incluso para los taxonomistas de plantas bien entrenados. Reversión de la JBG a un fenotipo agresivo verde no es también una rara ocurrencia. Uso de comparaciones de secuencias de codificación y las regiones variables del ADN tanto nuclear y del cloroplasto, que han confirmado que la JBG ha vuelto a la verde invasiva dentro de los estados de Maryland, Carolina del Sur y Missouri. JBG ha sido vendido y se plantaron en el estado de casi todos en los EE.UU. continentales donde no hay una infestación de plantas de cogongrass tengan activa. La magnitud del problema en volver no se entiende bien porque las plantas revertidas son indocumentados y destruyó a menudo.

La aplicación de este protocolo molecular proporciona un método para identificar JBG vuelve y puede ayudar a mantener estas variedades de co-produciendo unND posiblemente hibridar. Cogongrass es un outcrosser obligado y, al cruzarse con un genotipo diferente, puede producir el viento dispersa las semillas viables que se propagan plantas de cogongrass tengan en distancias ^5-7 de ancho. JBG tiene un genotipo ligeramente diferente que plantas de cogongrass tengan y puede ser capaz de formar híbridos viables con plantas de cogongrass tengan. Para agravar el problema, JBG es más frío y tolerante a la sombra de plantas de cogongrass tengan ^10.08, y el flujo genético entre estas dos variedades es probable que generen híbridos que son más agresivos, tolerante a la sombra, y resistente al frío que de tipo salvaje plantas de cogongrass tengan. Si bien de tipo salvaje plantas de cogongrass tengan actualmente infesta más de 490 millones de hectáreas en todo el mundo, en los EE.UU. el sudeste que infesta más de 500.000 hectáreas y es capaz de ocupar la mayor parte de los EE.UU., ya que rápidamente se extiende hacia el norte, debido a su nicho de amplia exposición geográfica y el potencial ^3,7,11. El potencial de un cruce genético es un motivo de grave preocupación para el Programa de USDA-APHIS Federal Semana nocivas. En la actualidad, el USDA-APHIS prohíbe la JBG en los estados quantes que hay grandes infestaciones Cogongrass (por ejemplo, la Florida, Alabama, Mississippi). Sin embargo, la prevención de las dos variedades de la combinación puede resultar más difícil, ya que plantas de cogongrass tengan JBG y ampliar su distribución. Además, la distribución de la JBG revertir es actualmente desconocido y sin la capacidad de identificar estas variedades a través de la morfología, algunos infestaciones Cogongrass puede ser el resultado de JBG revierte. Desafortunadamente, los métodos actuales de identificación molecular normalmente se basan en AFLP (Amplified polimorfismos de longitud de fragmentos) y secuenciación de DNA, los cuales son el tiempo y es costosa. A continuación, presentamos el primero de costo-efectiva y fiable basado en la PCR método de genotipificación molecular para distinguir con precisión entre las plantas de cogongrass tengan JBG y volver.

Protocolo

1. Recolección y Conservación

Este método fue desarrollado y probado usando frescas, congeladas, secas y, recientemente, los tejidos de las hojas.

1. Identificar las plantas de cogongrass tengan y / o tejidos JBG con la ayuda de un taxónomo que se especializa en la identificación de especies de hierba. Con sus hojas de color rojo brillante, JBG ornamentales es fácil de distinguir visualmente de tipo silvestre y plantas de cogongrass tengan JBG volver, sin embargo, plantas de cogongrass tengan y volver JBG son casi indistinguibles el uno del otro. Cogongrass y el fenotipo JBG volvió tienen hojas verdes, largas y rizomas considerablemente más grande y más largo y más área foliar que la JBG ¹² (Figura 1).
2. Tejido de la hoja fresca proporciona el ADN de calidad más abundante y la más alta y se pueden recoger desde el campo o invernadero crecido I. cylindrica plantas. Si el tejido fresco se va a utilizar, extraer el ADN dentro de las 3 horas de recogida para ayudar a prevenir la degradación. De lo contrario, preparar el tejido para el almacenamiento, keeping el tejido fresco y la luz solar directa.
3. Para almacenar los tejidos para la extracción de ADN en una fecha posterior, el método más óptimo es congelar y almacenar el tejido a -80 ° C inmediatamente. No permita que el tejido congelado se descongele antes de la extracción de ADN. Transferir el tejido congelado en nitrógeno líquido antes de la molienda de la extracción de ADN para prevenir la descongelación.
4. Si un -80 ° C congelador no está disponible, el tejido seco inmediatamente. Para el almacenamiento en seco, colocar el tejido en un sobre de papel y almacenar el sobre en gel de sílice deshidratado u otros desecantes activas a temperatura ambiente. Una pequeña cantidad de sílice mezclado con indicador no indica sílice se asegurará de que la sílice está completamente deshidratada y adecuado para secado tejido de la planta.
5. Utilice por lo menos 10 veces más gel de sílice que el tejido de hojas frescas en peso. Tejido vegetal debe secarse en 24 horas. La calidad y cantidad de ADN se reduce a través de almacenamiento en seco con el tiempo (como en el caso de ejemplar de herbarios).

2. Extracción de ADN

Para extraer el ADN de los tejidos vegetales, siga el DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, Cat # 69104 o 69106) las instrucciones del fabricante, con una pequeña modificación. En lugar de utilizar el sugerido menos de 100 mg de tejido fresco o inferior a 20 mg de tejido seco para cada columna, moler mayor que 100 mg, y luego transferir 100 mg de tejido fresco o congelado (o> 20 mg de tejido seco) a los tubos apropiados para la extracción. El ADN nuclear y plastidios se extrae de forma simultánea.

1. Antes de iniciar estos procedimientos, asegúrese de que el etanol se añadió a las reservas de AP3 / E y AW.
2. Moler> 100 mg de tejido foliar fresco o congelado (o> 20 mg de tejido de la hoja seca) a un polvo fino utilizando tres rondas de nitrógeno líquido con la molienda en un mortero y almirez refrigerados. Interrupción insuficiente del material de partida o lisis insuficiente también puede conducir a la disminución de los rendimientos de ADN. Con cuidado, moler el TISSUE y no sobrecargar las columnas con un exceso de tejido.
3. Transferir 100 mg de polvo congelado a partir de tejido fresco o congelado (o 20 mg de polvo de tejido seco) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 400 l de tampón AP1 y 4 l de RNasa A. puede Cada tubo colocado en un estante pequeño en un equilibrar para controlar el peso correcto de tejido por tubo.
4. Muestra de vórtice o vibración (s) para mezclar e incubar durante 10 min a 65 ° C, invirtiendo el tubo (s) de 2-3 veces durante la incubación.
5. Añadir 130 l de tampón de AP2 a cada muestra. Mezclar invirtiendo el tubo (s) varias veces, y se incuba durante 5 min en hielo.
6. Pipetear cada lisado en una columna de centrifugación QIAshredder separada Mini, y colocar cada columna en un tubo de recogida de 2 ml (suministrado con el kit). Se centrifuga la columna (s) por 2 min a 20.000 g (~ 14.000 rpm), y transferir cada fracción de flujo a través de en un tubo nuevo (no suministrado con el kit) sin interrumpir cualquier forma de pellets.
7. Añadir 1,5 volúmenes de tampón AP3 /E, y la mezcla por pipeteado.
8. Transferir 650 l de la mezcla en una columna de centrifugación DNeasy Mini en un tubo de recogida de 2 ml. Se centrifuga la columna (s) de 1 min a 6.000 xg (~ 8.000 rpm), y descartar el filtrado. Repetir este paso con la mezcla restante para cada muestra.
9. Colocar la columna de espín (s) en un nuevo tubo de recogida de 2 ml (s), y añadir 500 l de tampón AW a la parte superior de cada columna. Se centrifuga la columna (s) de 1 min a 6.000 xg (~ 8.000 rpm), y descartar el filtrado.
10. Añade otra l 500 de AW de Estabilización para la parte superior de cada columna. Centrifugar durante 2 minutos a 20.000 xg (~ 14.000 rpm). Este paso se seque la columna, eliminando así cualquier etanol residual contenida en los tampones que pueden inhibir la PCR.
11. Transfiera cada columna de centrifugación a un nuevo tubo de 1,5 ml de muestra de microcentrífuga. Añadir 100 l AE tampón a la parte superior de cada columna para la elución, e incubar la columna (s) durante 5 min a temperatura ambiente. Se centrifuga la columna (s) de 1 min a 6.000 xg (aproximadamente 8.000 rpm) para recoger el ADN.
12. Repetir estos pasos elución un tiempo, eluyendo el ADN en el mismo tubo de microcentrífuga 1,5 ml para dar 200 l de muestra. Guarde las muestras de ADN a -20 ° C hasta su uso. Concentraciones de ADN dependen del tipo de tejido y las condiciones de almacenamiento. Rendimientos óptimos se obtienen cuando eluyendo ADN con un total de 200 l de tampón AE, sin embargo, las concentraciones se puede aumentar si se reducen los volúmenes de elución a tan poco como 50 l.

3. Verificación de la calidad y cantidad de ADN

1. Prueba de la calidad y cantidad de ADN extraído antes de la instalación PCR utilizando un espectrofotómetro o fluorómetro y electroforesis en gel. Esto ayudará a asegurar el éxito de las etapas subsiguientes.
2. El uso de un espectrofotómetro, la calidad y la cantidad de pruebas de ADN. Los buenos rendimientos de ADN debe estar entre 50 y 150 ng / l con 260/280 y 230/280 proporciones cercanas a 2,0. Como un ejemplo, la Figura 2 muestra los resultados de buena calidad usando el espectrofotómetro NanoDrop (ThermoScientific, Wilmington, DE).
3. Llevar a cabo la electroforesis utilizando un estándar de 1% en gel de agarosa. Verificar la presencia de bandas relativamente grandes (> 10 Kb) sin rayas a poco de la contaminación del ARN (Figura 3).
4. Si la concentración de ADN es alta, el ADN de muestras diluidas a 70 ng / l para los pasos subsiguientes.

4. Los cebadores de PCR

La PCR primers utilizados en este protocolo se basa en las diferencias de secuencia entre la región espaciadora plastidio trnL-F de los genotipos Cogongrass y la JBG. Estas diferencias se presentan en forma de SNPs (polimorfismos de nucleótido único) y indeles (inserciones y eliminaciones) que permitieron el desarrollo de determinados variedad-cebadores mediante la localización de los cebadores en los sitios de secuencias únicas (Figura 4).

1. La calidad de los cebadores puede tener un impacto significativo sobre los resultados de la PCR. Orden cebadores de una empresa de renombre. Ordenamos a nuestras cartillas de Oblique Bio, Inc. (:/ / Www.obliquebio.com/web/ "target =" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), solicitando únicamente los procedimientos estándar de la desalación.
2. trnL-F cebadores de control positivos: Este conjunto de cebadores amplifica el plástido trnL-F región espaciadora de taxones más hierba ^11-13 y sirve como un buen control positivo (que resulta en una banda de 890 pb).
   

   Nombre	Secuencia
   TRNF (GAA)-F	5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 '
   trnL (5 'del exón)-C	5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 '

3. De tipo salvaje cebadores Cogongrass: Este primer conjunto es específico para plantas de cogongrass tengan y no amplificar la región trnL-F de la JBG genotipos. Los resultados expuestos en una banda que es 595 pb.
   

   Nombre	Ssuencia
   trnLF-C-F1	5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 '
   trnLF-C-R1	5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 '

4. JBG y la JBG Revert cebadores: Este es el juego de primers específicos para JBG genotipo y no amplifica la región trnL-F de plantas de cogongrass tengan. Los resultados expuestos en una banda que es 594 pb.
   

   Nombre	Secuencia
   trnLF-R-F2	5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 '
   trnLF-R-R2	5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 '

5. Resuspender cada cebador en un volumen suficiente de libre de nucleasa S ddH ₂ para obtener un 100 mM de soluciones de valores que pueden ser almacenadas a -20 ° C, a largo plazo.
6. Diluir cada acción de imprimación y 12 mm antes de los pasos de configuración de la PCR.

5. PCR de configuración

Extracciones de ADN se amplificó utilizando cada uno de los conjuntos de cebadores anteriores en las reacciones de PCR. Incluir un control positivo para garantizar que todos los reactivos de PCR están funcionando bien y puede generar una banda. Incluir un control negativo para asegurar que ninguno de los reactivos están contaminados con ADN deseado. El control negativo no contiene-plantilla y debe dar lugar a ninguna producción banda.

1. Preparar todas las reacciones en tubos de paredes finas de la PCR para permitir una mejor transferencia de calor entre el bloque termociclador y la muestra. Se recomienda utilizar disponibles en el mercado de aerosoles libres de puntas de pipeta para ayudar a evitar la contaminación.
2. Para cada muestra de ADN aislado, establecido de 50 l reacciones de PCR utilizando cada uno de los conjuntos de primer sobre en 0,2 ml de pared delgada, tubos de PCR mediante la adición de los siguientes reactivos en la ICE en el orden indicado a continuación. Si las muestras múltiples están siendo preparados, hacer un cóctel que contiene todos los reactivos con la excepciónde la plantilla de ADN para establecer condiciones uniformes entre todas las reacciones.
   

   Reactivo PCR	Volumen usado	Concetration final
   Libre de nucleasa ddH2O	40,5 l
   Ventaja 2 10X PCR buffer (Clonetech, CA)	5,0 l	10% (v / v)
   Ventaja UltraPure PCR Mezcla de dNTP (10 mM cada uno, Clonetech, CA)	1,0 l	0,2 mM
   Primer 1 (12μM en ddH2O)	1,0 l	0,24 mM
   Primer 2 (12μM en ddH2O)	1,0 l	0,24 mM
   Ventaja 2 polimerasa Mix (Clonetech, CA)	0,5 l	1% (v / v)
   De extracción de ADN(70 ng / reacción, ajustar el volumen ddH 2 O, según sea necesario)	1,0 l	1,4 ng / l
   	Total: 50,0 l

3. Para asegurarse de que todos los reactivos de PCR están funcionando bien, configurar el control positivo utilizando los cebadores de control positivo. Este primer conjunto funciona igualmente bien para plantas de cogongrass tengan, JBG, JBG revertir y otras gramíneas y dará lugar a una banda que es de 890 pb.
4. Configuración del control negativo usando el cebador mismo control establecido como control positivo, utilizando ddH ₂ O en lugar de la extracción de ADN. Si todos los reactivos están libres de ADN contamina, esta reacción se traducirá en ninguna banda.
5. Si la concentración de ADN es baja, más ADN se puede añadir a cada reacción, ajustando la cantidad de libre de nucleasa S ddH ₂ utilizado para llevar el volumen total de reacción a 50 l. No use más de 5 l de ADN (10% del el volumen total) por reaction, impurezas como posibles contenidos en las muestras de ADN puede inhibir las reacciones de PCR.

6. PCR ciclismo

1. Llevar a cabo amplificaciones de PCR en un termociclador equipado con una tapa térmica con los siguientes parámetros de PCR en bicicleta. Usamos el Mastercycle Pro S termociclador (Eppendorf, Hauppauge, NY) para operar con las condiciones estándar de temperatura rampa. Cualquier termociclador de la calidad debería funcionar bien.
   

   Ciclo	La desnaturalización de recocido	Polimerización
   1	2 min a 95 ° C
   2	30 segundos a 95 ° C	30 segundos a 61 ° C 90 seg a 68 ° C 35 ciclos
   3		5 min a 68 ° C
   Mantener a 4 ° C hasta que la muestra se retira

2. Optimizar las condiciones para la PCR (incluyendo la temperatura hibridación del cebador, los tiempos de extensión, y el número de ciclos) según sea necesario dependiendo de la calidad del ADN, los cebadores, Taq polimerasa o el tipo de termociclador utilizado. Recomendamos utilizar un termociclador capaz gradiente al determinar el óptimo temperaturas de recocido.
3. Si el termociclador siendo utilizado no tiene una tapa calentada, añadir 1 gota de aceite mineral a la parte superior de cada muestra para evitar la evaporación durante los ciclos de PCR.

7. Electroforesis en gel de los productos de PCR

Para visualizar los resultados del análisis, separados los productos de PCR en un 1% en gel de agarosa mediante electroforesis estándar.

1. Combinar 2 l de un tampón de ADN de carga estándar (típicamente una solución 5x o 6x) con 5 l de cada producto de PCR amplificado.
2. Cargar las muestras en un gel de agarosa al 1% que contenga bromuro de etidio (bromuro de etidio para la tinción de ADN) hizo con el correoither TAE o SB (borato de sodio) los sistemas de amortiguación ^16. Usamos 1 l de un 10 mg / ml de solución madre de EtBr por 100 ml de agarosa al 1% (0,1 g / ml).
3. Ejecutar las muestras a ~ 120V hasta que el frente de colorante llega a ¾ de la longitud total del gel.
4. Bajo la luz ultravioleta (por ejemplo, un UV de onda corta caja de luz), inspeccionar las bandas resultantes para ver si un fragmento de su caso se amplificó.
5. Documentar el gel y las bandas que resulten disponibles mediante un foto-documentación del sistema o de la cámara.

8. Los resultados representativos

Tras la visualización de los productos de PCR, plantas de cogongrass tengan tiene un patrón único de bandas en comparación con la de JBG o revertido JBG (Figura 5). Para cada muestra de ADN, el trnL-F positivo conjunto de cebadores de control debe dar lugar a una sola de alta intensidad de la banda de ~ 890 pb. Esto verifica que todos los reactivos de PCR están funcionando bien. Del mismo modo, el control negativo (sin plantilla) la reacción no debe contener las bandas para cualquier s imprimaciónet utilizado. Esto verifica que ninguno de los reactivos estaban contaminadas.

Si la muestra de ADN se deriva de tipo salvaje plantas de cogongrass tengan, una reacción PCR utilizando el conjunto de cebadores específicos de plantas de cogongrass tengan resultará en una banda única en ~ 595 pb, mientras que los cebadores específicos de JBG resultará en ninguna banda. Asimismo, si la muestra de ADN se deriva de JBG o revertido JBG, una reacción PCR utilizando el conjunto de cebadores JBG-específica se traducirá en una banda única en ~ 594 pb, mientras que los cebadores específicos de plantas de cogongrass tengan resultará en ninguna banda. Como JBG y JBG volvió tienen una secuencia idéntica de ácido nucleico, que por lo tanto, se tienen los mismos patrones de bandas. Si muchas muestras se compararon en un gel al mismo tiempo, se recomienda ejecutar todas las muestras derivadas de cada cebador situado junto a una otra, haciendo así más fácil para escanear las muestras para los resultados positivos.

Las diferencias morfológicas entre las JBG y vuelve JBG son bastante obvias (por ejemplo, el color rojo de las hojas y la talla de JB G vs la coloración verde, mayor estatura y el crecimiento agresivo de la JBG volver), así que mientras los resultados de PCR será el mismo, las variedades JBG son fáciles de distinguir con morfología de la planta.

Figura 1. Comparación de efecto invernadero crecido Imperata cylindrica var. Koenigii (hierba sangre japonesa), volvió I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) y I. cylindrica (de tipo salvaje plantas de cogongrass tengan).

Figura 2. Un ejemplo de muestras de ADN verificadas utilizando un espectrofotómetro NanoDrop. Nótese que, con independencia del espectrofotómetro utilizado, la relación 260/280 debe estar cerca de 1,8 y la relación de 260/230 debe cerrar a 2,0.

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Muestras Figura 3. ADN verificada mediante electroforesis en gel estándar en un 1% en gel de agarosa. Un marcador de ADN comercial se utilizó para el análisis de tamaño. Lane # 4 es un ejemplo de muestra pobre calidad de ADN, que muestra manchas y cierta contaminación del ARN.

Alineaciones Figura 4. Secuencia de las regiones F-trnL de Imperata cylindrica var. Koenigii (hierba sangre japonesa), volvió I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) y I. cylindrica (de tipo salvaje plantas de cogongrass tengan). Verticales flechas negras indican diferencias en las secuencias que resultan de los SNPs y indeles. Horizontal flechas verdes indican las posiciones de los cebadores de tipo salvaje Cogongrass utilizados para plantas de cogongrass tengan PCR específica. Horizontal flechas rojas indican la posiciones de la JBG y la JBG Revert primers utilizados para la JBG-PCR específica.

Figura 5. Resultado representativo de electroforesis en gel de los productos de PCR derivados de plantas de cogongrass tengan, JBG y JBG revertir muestras de ADN combinadas con Cogongrass-y JBG cebadores específicos, así como la trnL-F de control positivo y un control sin molde negativo.

Discusión

El vivero de EE.UU. y las industrias del paisaje prosperan en el cultivo y venta de especies de plantas exóticas y la novela. Esto, junto con la creciente globalización del comercio, aumenta las posibilidades de que las especies de plantas invasoras entran, establecer y difundir en los EE.UU. La posibilidad de regular por el gobierno federal tales plantas se basa en la información que a menudo no es disponible, incluyendo el potencial de convertirse en invasoras , la taxonomía correcta, y la distinción genética de taxones nativos y naturalizados. Debido a que nuestro conocimiento de las plantas invasoras es a menudo limitada, las plantas importadas con ocultos características invasoras se han introducido voluntariamente sólo para descubrir después que invaden nuestros recursos agrícolas y naturales. Este protocolo tiene como objetivo hacer frente a este tipo de problemas asociados con la I. cylindrica variedades, proporcionando el primer método simplificado molecular que puede distinguir exactamente entre la naturaleza y tipo de plantas de cogongrass tengan y la forma de revertir de su contraparte JBG ornamentales.

jove_content "> Para el desarrollo de este protocolo, de tipo salvaje plantas de cogongrass tengan se recogió a partir de poblaciones naturalizadas de la Unidad de Pond Creek Forestal en el Condado de Santa Rosa cerca de Jay, Florida, en junio de 2008. JBG fue adquirido en un vivero comercial (Bluebird Nursery, Inc. ..) en junio de 2008, así como de la colección de propietario de una casa en Columbia, MO JBG vuelve se obtuvieron desde el patio del Museo Campbell Geológica de la Universidad de Clemson, Carolina del Sur en junio de 2008, de la Universidad Park en Riverdale, MA en junio de 2009, y en el patio delantero de un dueño de una casa en Columbia, MO en 2009 (identificados por Leland Cseke). Todas las plantas se mantuvieron en un invernadero ubicado en la Universidad de Alabama en Huntsville (Huntsville, AL).

La secuenciación genética de ADN recogidas en esas plantas incluidas en la comparación de la profundidad de 9 regiones de ADN independientes, comúnmente utilizados para ² plantas de código de barras. En todos los casos, las secuencias de JBG eran un partido 100% a las de la JBG revertir, ayudando así averificar que en efecto, la JBG revertir a una forma verde, invasivo. Sólo el ITS nuclear y las regiones del cloroplasto F trnL-tienen diferencias que pueden ser utilizados para distinguir entre plantas de cogongrass tengan genéticamente y JBG. La región ITS cuenta con un total de 3 SNPs (polimorfismos de nucleótido único) entre plantas de cogongrass tengan y la JBG, mientras que la región trnL-F tiene dos SNPs y indeles 2 (inserciones y deleciones). Estas diferencias genéticas específicas permite gran variedad-PCR a desarrollar que puede distinguir entre la naturaleza y tipo de plantas de cogongrass tengan y vuelve JBG. Los resultados más fiables provienen de primers derivados de la plastidio trnL-F región. Por lo tanto, este protocolo se basa en la secuencia de las diferencias entre las regiones trnL-F del genoma del cloroplasto de plantas de cogongrass tengan, JBG y revertidas JBG (Figura 4).

Para ayudar a generar cebadores que son más específicos para las variedades en cuestión y para ayudar a evitar los falsos positivos de las especies estrechamente relacionadas, all conocidos trnL-F secuencias de I. variedades cylindrica se compararon con trnL-F secuencias de especies de gramíneas (43 relacionados con las secuencias independientes de 29 especies, por ejemplo, Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum y Coix lacryma-jobi, Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum, Sorghum halepense). Aunque, hemos examinado específicos variedad-secuencias de los cebadores a través de 29 especies de hierba, la especificidad de los cebadores específicos variedad-no ha sido ampliamente examinado por su capacidad para amplificar el ADN de la mayoría de otras especies gramíneas. En consecuencia, el tejido utilizado para la extracción de ADN deben ser cuidadosamente identificados como I. cylindrica antes de iniciar este protocolo. Si la hierba no se puede identificar, ya sea como plantas de cogongrass tengan o JBG, entonces le sugerimos la secuenciación del producto de PCR para asegurarse de que las secuencias son una coincidencia exacta con plantas de cogongrass tengan o JBG. Actualmente, el método más exacto para verificar la identidad de un espécimen hierba dado es llevar a cabo la PCR en tanto el trnl-F y de sus regiones, seguida de verificación de la secuencia de los productos de la PCR y la comparación de las secuencias a secuencias conocidas de los taxones identificados con precisión. ADN puede ser amplificado utilizando cebadores de control que se detallan en este protocolo (para la región trnL-F) o cebadores otros disponibles en otras publicaciones ^13-15. La secuencia es la mano de obra mucho más y costosa que el uso de nuestro procedimiento simplificado.

La calidad de los cebadores utilizados para la PCR es crítico para el éxito del procedimiento. Hemos hecho los iniciadores de este procedimiento disponible en oblicuo Bio, Inc. ( http://www.obliquebio.com/web/ , Huntsville, AL). La ventaja de ordenar los cebadores de Bio oblicua es que almacenar un gran número de partes alícuotas de cada cebador de la serie de muestras de producción idénticos como los cebadores que se utilizan para la optimización en nuestro laboratorio. En consecuencia, no sólo cebadores tienen la misma secuencia, pero they provienen del lote de producción exactamente el mismo que se utilizó en este protocolo. El uso de primers de un mismo lote, puede ayudar a evitar las variables extrañas en el procedimiento que pueda resultar de las diferencias en la calidad de los cebadores de PCR. Asimismo, mientras que otras polimerasas Taq debería funcionar bien para la PCR, la calidad de la Taq polimerasa utilizada tendrá un impacto sobre la calidad de los resultados de la PCR. Para permitir una mejor consistencia en los reactivos de PCR, hemos optimizado el protocolo de uso de los reactivos de Clontech. La ventaja de dos polimerasa (Clontech, Mountain View, CA, Cat # 639201 o 639202) es una mezcla de un sistema robusto, de arranque en caliente Taq polimerasa y una enzima prueba de lectura que ayuda a proporcionar una alta especificidad y ampliaciones más precisos.

Debido a que este protocolo se basa en el ADN del cloroplasto, que es heredado de la madre en los pastos, los sucesos de hibridación entre plantas de cogongrass tengan JBG y los genotipos no pueden ser capturados con nuestro procedimiento de identificación molecular. En los casos en que es hypridization suspeDirección Ejecutiva, le recomendamos que utilice las regiones nucleares que se heredan de ambos padres. Los más comúnmente utilizados no plastídico región variable a considerar en la determinación del genotipo de plantas es la región ITS ribosomal nuclear ^13-15,17. En la actualidad, estamos avanzando hacia la multiplexación de la amplificación de los cloroplastos trnL-F región con la de su región de la central nuclear en el mismo tubo de PCR. Multiplexación plastidio con las regiones de ADN nuclear potencialmente eludir las limitaciones de utilizar ya sea solo, sin embargo, estos métodos requieren la optimización y evaluación adicional para determinar la viabilidad de una base de caso por caso. El uso de indicadores cuantitativos PCR en tiempo real (qPCR) y las nuevas tecnologías, tales como marcadores moleculares (sondas fluorescentes de imprimación), también están siendo evaluados como métodos de genotipado a prueba de fallos y exacta de la planta.

El protocolo que aquí se presenta ofrece un método rápido y fiable para distinguir la JBG volver a la de tipo salvaje plantas de cogongrass tengan. Le recomendamos utilizarrs de este protocolo para comunicarse con nosotros para informar sobre los resultados derivados de la utilización de este protocolo. Dicha información compartida ayudará a proporcionar información sobre la distribución de la JBG se revierte. Esto también ayudará a los reguladores en el Departamento de Agricultura a tomar decisiones informadas sobre las acciones que pueden ser necesarias para evitar la propagación y la hibridación potencial de las variedades Cogongrass altamente invasivos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen, Valencia, CA	69104 o 69106	Cualquier planta de renombre genómico kit de ADN que se obtiene ADN de buena calidad debe trabajar muy bien para estos procedimientos.
TRNF (GAA)-F	Oblicua Bio, Inc.	3-0578	De control de avance positivo imprimación
trnL (5 'del exón)-C	Oblicua Bio, Inc.	3-0579	Invertir cebador control positivo
trnLF-C-F1	Oblicua Bio, Inc.	3-0864	Avance de tipo salvaje plantas de cogongrass tengan imprimación
trnLF-C-R1	Oblicua Bio, Inc.	3-0865	Marcha atrásde tipo salvaje plantas de cogongrass tengan imprimación
trnLF-R-F2	Oblicua Bio, Inc.	3-0866	Adelante y la JBG JBG volver imprimación
trnLF-R-R2	Oblicua Bio, Inc.	3-0867	Invertir JBG JBG y volver imprimación
Ventaja UltraPure PCR dNTP Mix	Clontech, Mountain View, CA	639125
Ventaja 2 de la polimerasa	Clontech, Mountain View, CA	639201 o 639202	Una buena prueba de lectura, de arranque en caliente de Taq polimerasa