Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con ImageJ.
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Artículo de método
Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital
En este artículo
Resumen
Resumen
El reclutamiento de leucocitos circulantes del torrente sanguíneo al tejido inflamado es un proceso crucial y compleja de 1,2 inflamación. En las vénulas postcapilares de tejido inflamado, leucocitos inicialmente cuerda y rodar sobre la superficie luminal de la pared venular. Rolling arresto leucocitos en el endotelio y se someten a la adhesión firme en respuesta a quimioquinas o quimiotácticos otros en la superficie venular. Muchos leucocitos adherentes trasladarse desde el sitio inicial de la adhesión al lugar de la extravasación de la unión en el endotelio, un proceso denominado intraluminal arrastrándose 3. Después de gatear, los leucocitos se mueven a través del endotelio (transmigración) y migran en el tejido extravascular hacia la fuente de quimioatrayente (quimiotaxis) 4. Microscopia intravital es una poderosa herramienta para la visualización de las interacciones leucocito-endotelial de células in vivo y revelar los mecanismos celulares y moleculares de reclutamiento de leucocitos 2,5. En este informe, se presenta una descripción completa de la utilización de la microscopía intravital campo claro para visualizar y determinar los procesos detallados de reclutamiento de neutrófilos en el ratón músculo cremáster en respuesta a la pendiente de un quimioatrayente de neutrófilos. Para inducir el reclutamiento de neutrófilos, un pequeño trozo de gel de agarosa (~ 1 mm de tamaño 3) con recuento de neutrófilos chemoattractant MIP-2 (CXCL2, una quimiocina CXC) o WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, un análogo sintético del péptido bacteriano) se coloca en el tejido muscular adyacente a la vénula postcapilares observado. Con el tiempo transcurrido fotografía de vídeo y el ordenador el software ImageJ, el rastreo de neutrófilos intraluminal en el endotelio, la migración de neutrófilos y transendotelial la migración y la quimiotaxis de los tejidos se visualizan y seguimiento. Este protocolo permite a los análisis cuantitativos y fiables de muchos parámetros de reclutamiento de neutrófilos, tales como la velocidad de rastreo intraluminal, el tiempo de la transmigración, el tiempo de separación, la velocidad de la migración, la velocidad de la quimiotaxis y el índice de quimiotaxis en el tejido. Se demuestra que el uso de este protocolo, estos parámetros el reclutamiento de neutrófilos puede ser estable y determinado la locomoción sola célula convenientemente seguimiento en vivo.
Protocolo
1. Preparación de quimioatrayente en gel de agarosa
- Pipeta de 10 ml de 2 × PBS en un tubo cónico de 50 ml, y calentar el tubo por ponerlo en un recipiente que contiene agua caliente.
- Pipeta de 10 ml de agua destilada y añadir 0,4 g de polvo de agarosa en otro tubo cónico de 50 ml (con la tapa ligeramente floja) y calentar la mezcla hasta que esté hirviendo en un horno de microondas (para ~ 1 min en un horno microondas de 700 vatios) .
- Agregue el calentado de 2 × PBS a la solución de agarosa al tubo, agitar la solución mixta y mantenerlo caliente en el vaso de agua caliente.
- Micropipeta solución quimiotáctica (por ejemplo, 10 l....
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Discusión
Microscopia intravital es la herramienta esencial para revelar los mecanismos celulares y moleculares de reclutamiento de leucocitos durante la inflamación. Visualización para la determinación cuantitativa de las interacciones leucocito-endotelial en la microvasculatura de los tejidos translúcidos como el músculo cremáster y mesenterio sigue siendo el estándar de oro para la aplicación de la técnica de 1,5. La microscopía de campo claro intravital convencional tiene muchas características técnicas únicas y lo.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR, MOP-86749). L. Liu es un recipiente del Premio de CIHR Nueva Investigador (MSH-95374).
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Materiales
Tabla: Materiales, reactivos y equipos específicos
| Nombre del reactivo / equipo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Tubo de polietileno, PE10 | Becton Dickinson | 427401 | ID 0.28mm x 0.61mm OD |
| Tinta china | Speedball Arte | Super Negro | 100% de pigmento negro de humo no colorantes |
| Cauterización | Aaron Médico | AA03 | |
| Xilazina | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| El clorhidrato de ketamina | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| MIP-2 recombinante murino | R & D Systems | 452-M2 | |
| WKYMVm | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 072-12 | |
| Agarosa | Invitrogen | 15510-027 | Ultrapura |
| Heparina | Sigma | H-3393 | |
| Microscopio vertical | Olimpo | BX61WI | |
| Color 3CCD cámara de vídeo | SONY | DXC-990 | |
| HD-DVD grabador de vídeo | LG Electronics Inc. | RH398H-M | |
| Monitor de TV | LG Electronics Inc. | 22LG30 | |
| Agua circulante | Thermo Scientific | HAAKE DC10 | |
| Bomba peristáltica | Gilson, Pharmacia | Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 | |
| Cremaster bordo del músculo | Universidad de Saskatchewan | Hecho en casa |
Referencias
- Liu, L., Kubes, P. Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action. Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).
- Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J. Immunol. ....
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Reimpresiones y permisos
