Cambio de la dirección y la orientación del campo eléctrico durante la aplicación pulsos eléctricos Mejora la transferencia de genes plásmido In vitro</em

Resumen

Transfección de genes mediante electroporación se mejora aproximadamente dos veces en la orientación del campo eléctrico se modifica durante la aplicación de pulsos, mientras que la viabilidad celular no se ve afectada. El aumento de la transfección de genes es causada por el aumento de la superficie de membrana que se hace competente para la entrada de ADN en la célula.

Resumen

Gene electrotransferencia es un método físico utilizado para introducir genes en las células mediante la aplicación de pulsos eléctricos cortos e intensos, que provocan la desestabilización de la membrana celular, por lo que es permeable a pequeñas moléculas y permite la transferencia de moléculas grandes como el ADN. Representa una alternativa a los vectores virales, debido a su seguridad, eficacia y facilidad de aplicación. Para el gen de electrotransferencia diferentes protocolos de impulsos eléctricos se utilizan con el fin de lograr la máxima transfección de genes, uno de ellos es cambiar la dirección del campo eléctrico y la orientación durante la entrega de pulso. Cambio de la dirección del campo eléctrico y la orientación de aumentar la superficie de la membrana competente para la entrada de ADN en la célula. En este video, se demuestra la diferencia en la eficacia del gen electrotransferencia cuando todos los pulsos son entregados en la misma dirección y, cuando las leguminosas son entregados por el cambio, alternativamente, la dirección del campo eléctrico y la orientación. Para este propósito la punta con electrodos integrados y de alta tensión del generador prototipo, que permite cambiar de campo eléctrico en diferentes direcciones durante la aplicación de pulsos eléctricos, fueron utilizados. Gene eficacia electrotransferencia se determina 24 horas después de la aplicación de pulsos como el número de células que expresan la proteína verde fluorescente dividido por el número de todas las células. Los resultados muestran que la transfección de genes se incrementa cuando la orientación del campo eléctrico durante la entrega de impulsos eléctricos se cambia.

Protocolo

1. Cultivo de células, plásmido y la preparación de amortiguamiento para el experimento

1. En este experimento células ováricas de hámster chino (CHO-K1) se utilizan. Las células se cultivan en una mezcla de nutrientes HAM-F12 (PAA) suplementado con 2 mM L-glutamina, un 10% de suero fetal bovino, 400 l / l de gentamicina (todos de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Alemania), y 1 ml / l crystacilin (Pliva, Zagreb, Croacia). Las células se mantuvieron a 37 º C en un humidificado _5% de CO2 la atmósfera en la incubadora durante 24 horas.
2. Amplificar plásmido pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, EE.UU.) que codifica la proteína verde fluorescente (GFP) en la cepa de Escherichia coli DH5a y aislarlo con Kit Hi-Speed ​​Maxi plásmido (Qiagen, Hilden, Alemania). Concentración de ADN plásmido (plásmido disuelto en buffer TE) debe ser determinado por espectrofotometría a 260 nm y se confirmó por electroforesis en gel.
3. Prepare el buffer de isoosmolar fosfato de sodio (10 mM Na ₂ HPO _4, 10 mM NaH ₂ PO _4, 1 mM MgCl _2, 250 mM de sacarosa, pH 7,4).
4. En el día del experimento de preparar la suspensión de células por tripsinización con 0,25% de tripsina / EDTA (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Alemania). Las células se centrifuga durante 5 min a 1000 rpm (180 xg) a 4 ° C (Sigma, Alemania) y resuspender el sedimento celular en tampón fosfato de sodio isoosmolar a una densidad celular de 5 x 10 ⁶ células / ml.

2. Equipo de hardware

1. Las células son expuestas a campos eléctricos en la punta de la pipeta (Figura 1) con electrodos integrados conectados a un generador prototipo de alta tensión. La punta y la geometría de los electrodos permite la aplicación de campo eléctrico relativamente homogénea y el generador permite el envío de pulsos eléctricos en diferentes direcciones. La punta y el generador se desarrollaron en el Laboratorio de Biocibernética, Facultad de Ingeniería Eléctrica de la Universidad de Ljubljana ^1.

Figura 1. Vertical y horizontal (a) sección transversal y la fotografía (b) de la punta de la pipeta con electrodos integrados. En la sección transversal de color gris se utiliza para la carcasa de plástico y el negro para los electrodos. La punta de la pipeta con electrodos integrados consta de cuatro electrodos de barra cilíndrica. Los electrodos son de acero inoxidable, su diámetro es de 1,4 mm, electrodos adyacentes son 1 mm, y los electrodos opuestos son 2 mm. Los electrodos se pegan en la punta de plástico en paralelo y su longitud de aplicación es de 30 mm ^2.

3. Gene electrotransferencia protocolo

1. Añadir plásmido pEGFP-N1 a una suspensión celular en la concentración de 10 ug / ml.
2. Incubar la mezcla durante 2-3 minutos a temperatura ambiente, antes de la aplicación de pulsos eléctricos.
3. Aspire 100 l de suspensión de células en la punta de la pipeta con electrodos integrados.
4. Para lograr la mejor eficacia de electrotransferencia gen y mantener la viabilidad celular, los parámetros óptimos de los impulsos eléctricos se debe utilizar. En este experimento, un tren de 8 pulsos rectangulares (cada uno con duración de 1 ms, la amplitud de 225 V a una frecuencia de repetición Hz) se aplica a cada muestra, utilizando alta tensión del generador prototipo. Dos diferentes protocolos de campo eléctrico (Figura 2) se utilizan: en el primer protocolo de todos los pulsos son entregados en la misma dirección, mientras que en los pulsos de segundo protocolo se entregan al cambiar alternativamente la dirección del campo eléctrico y la orientación. El segundo protocolo sólo se puede usar con generador de impulsos adecuados, lo que permite la aplicación de pulsos eléctricos en diferentes direcciones.
5. Inmediatamente después de la aplicación de pulsos de transferencia de las células de la punta de la pipeta en 6 pocillos y añadir suero fetal bovino (FCS-Sigma, EE.UU.) (25% del volumen de la muestra).
6. Se incuban las células durante 5 min a 37 ° C para permitir que el resellado de la membrana celular.
7. Añadir 2 ml de HAM-F12 para cada muestra en 6 pocillo e incubar las células durante 24 horas a 37 ° C en un humidificado _5% de CO2 la atmósfera en la incubadora.

. Figura 2 protocolos de campo eléctrico: (a) todos los pulsos son entregados en la misma dirección, (b) Los pulsos son entregados por el cambio, alternativamente, la dirección del campo eléctrico y la orientación.

4. De adquisición de imágenes y la determinación de la eficacia del gen electrotransferencia

1. La eficacia del gen electrotransferencia se determina como el porcentaje de células que expresan GFP 24 horas después de la aplicación de pulsos.
2. Las células se observan con un microscopio de fluorescencia (en nuestro caso Zeiss 200, Axiovert, ZR Alemania) con luz de excitación a 488 nm generada por un sistema monocromador (policroma IV, Visitron, Alemania) y la emisión se detecta a 507 nm. Las imágenes se graban mediante imágenes de sistema (sistema de imagen MetaMorph, Visitren, Alemania), pero otro software de adquisición similar también se puede utilizar.
3. Adquirir al menos cinco imágenes (contraste de fases y fluorescencia verde) en el aumento del objetivo de 20x.
4. Recuento de células en la imagen de contraste de fase y las células que expresan GFP en la imagen de fluorescencia verde. Determinar el porcentaje de eficacia del gen electrotransferencia dividiendo el número de células que expresan GFP con el número de todas las células en cada imagen correspondiente (Figura 3).

5. Los resultados representativos:

Figura 3. El porcentaje de células que expresan GFP cuando todos los pulsos son entregados en la misma dirección y, cuando las leguminosas son entregados por el cambio, alternativamente, la dirección del campo eléctrico y la orientación se presenta. Las células fueron expuestas a un tren de ocho pulsos con amplitud de 225 V, la duración de 1 ms y la frecuencia de repetición de 1 Hz. Los resultados fueron obtenidos por medio de microscopía de fluorescencia. Cada valor en el gráfico representan la media de tres experimentos independientes ± desviación estándar. Al cambiar la dirección del campo eléctrico y la orientación que el porcentaje de células que expresan GFP aumenta.

Discusión

Gene electrotransferencia es una técnica versátil que la biotecnología permite la transferencia de ADN en las células mediante la aplicación de pulsos cortos, de alta tensión eléctrica ³ y representa una alternativa más segura a los vectores virales, debido a su seguridad, eficacia y facilidad de aplicación. Aunque hoy en día electrotransferencia gen es ampliamente utilizado para transfectar todos los tipos de células y la primera fase I de ensayos clínicos con este método se ha reportado ^4, los me...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
HAM-F12	PAA	E15-016	medio de cultivo
L-glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
de suero fetal bovino	PAA	A15-151
gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397	antibiótico
crystacilin	Pliva	625110	antibiótico
pEGFP-N1	Clontech Laboratories	6085-1	ADN plásmido
Kit Hi-Speed ​​Maxi plásmido	Qiagen	12662
Na 2 HPO 4	Merck	F640786 933
NaH 2 PO 4	TKI Hrastnik	0795
MgCl2	Sigma-Aldrich	M-8266
sacarosa	Sigma-Aldrich	16104
tripsina / EDTA	Sigma-Aldrich	T4174
punta de la pipeta	Una medida que se
eléctrica del generador de impulsos	Una medida que se
6 pocillos	TPP	92406
15 ml tubo de centrífuga	TPP	91015
75 cm 2 frasco de la cultura	TPP	90076