Transfección de genes mediante electroporación se mejora aproximadamente dos veces en la orientación del campo eléctrico se modifica durante la aplicación de pulsos, mientras que la viabilidad celular no se ve afectada. El aumento de la transfección de genes es causada por el aumento de la superficie de membrana que se hace competente para la entrada de ADN en la célula.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Cambio de la dirección y la orientación del campo eléctrico durante la aplicación pulsos eléctricos Mejora la transferencia de genes plásmido In vitro
En este artículo
Resumen
Resumen
Gene electrotransferencia es un método físico utilizado para introducir genes en las células mediante la aplicación de pulsos eléctricos cortos e intensos, que provocan la desestabilización de la membrana celular, por lo que es permeable a pequeñas moléculas y permite la transferencia de moléculas grandes como el ADN. Representa una alternativa a los vectores virales, debido a su seguridad, eficacia y facilidad de aplicación. Para el gen de electrotransferencia diferentes protocolos de impulsos eléctricos se utilizan con el fin de lograr la máxima transfección de genes, uno de ellos es cambiar la dirección del campo eléctrico y la orientación durante la entrega de pulso. Cambio de la dirección del campo eléctrico y la orientación de aumentar la superficie de la membrana competente para la entrada de ADN en la célula. En este video, se demuestra la diferencia en la eficacia del gen electrotransferencia cuando todos los pulsos son entregados en la misma dirección y, cuando las leguminosas son entregados por el cambio, alternativamente, la dirección del campo eléctrico y la orientación. Para este propósito la punta con electrodos integrados y de alta tensión del generador prototipo, que permite cambiar de campo eléctrico en diferentes direcciones durante la aplicación de pulsos eléctricos, fueron utilizados. Gene eficacia electrotransferencia se determina 24 horas después de la aplicación de pulsos como el número de células que expresan la proteína verde fluorescente dividido por el número de todas las células. Los resultados muestran que la transfección de genes se incrementa cuando la orientación del campo eléctrico durante la entrega de impulsos eléctricos se cambia.
Protocolo
1. Cultivo de células, plásmido y la preparación de amortiguamiento para el experimento
- En este experimento células ováricas de hámster chino (CHO-K1) se utilizan. Las células se cultivan en una mezcla de nutrientes HAM-F12 (PAA) suplementado con 2 mM L-glutamina, un 10% de suero fetal bovino, 400 l / l de gentamicina (todos de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Alemania), y 1 ml / l crystacilin (Pliva, Zagreb, Croacia). Las células se mantuvieron a 37 º C en un humidificado 5% de CO2 la atmósfera en la incubadora durante 24 horas.
- Amplificar plásmido pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, EE.UU.) que codifica la....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Gene electrotransferencia es una técnica versátil que la biotecnología permite la transferencia de ADN en las células mediante la aplicación de pulsos cortos, de alta tensión eléctrica 3 y representa una alternativa más segura a los vectores virales, debido a su seguridad, eficacia y facilidad de aplicación. Aunque hoy en día electrotransferencia gen es ampliamente utilizado para transfectar todos los tipos de células y la primera fase I de ensayos clínicos con este método se ha reportado 4, los me.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Agencia de Investigación de Eslovenia (proyecto J2-9770, IP-0510 centro de la infraestructura y el programa P2-0249). Este video representa el material complementario para la "base de electroporación, tecnologías y tratamientos" taller científico y postgrado, organizado por la Facultad de Ingeniería Eléctrica de la Universidad de Ljubljana, en Eslovenia. Los autores agradecen también Dusa Hodzic por la amabilidad de proporcionar el ADN del plásmido.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| HAM-F12 | PAA | E15-016 | medio de cultivo |
| L-glutamina | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| de suero fetal bovino | PAA | A15-151 | |
| gentamicina | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiótico |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiótico |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | ADN plásmido |
| Kit Hi-Speed Maxi plásmido | Qiagen | 12662 | |
| Na 2 HPO 4 | Merck | F640786 933 | |
| NaH 2 PO 4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sacarosa | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| tripsina / EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| punta de la pipeta | Una medida que se | ||
| eléctrica del generador de impulsos | Una medida que se | ||
| 6 pocillos | TPP | 92406 | |
| 15 ml tubo de centrífuga | TPP | 91015 | |
| 75 cm 2 frasco de la cultura | TPP | 90076 |
Referencias
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for sma....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
