Se describe un procedimiento para la desagregación de cáncer colorrectal (CCR) para producir células viables único, que son capturados en microarrays de anticuerpos a medida el reconocimiento de los antígenos de superficie (CRC DotScan microarrays). Subpoblaciones de células obligado a los microarrays pueden ser perfiladas por multiplexación de fluorescencia utilizando anticuerpos monoclonales marcados con colorantes fluorescentes.
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Artículo de método
Celular del cáncer colorrectal superficie de la proteína perfiles con un microarray de anticuerpos y la multiplexación de fluorescencia
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Resumen
Resumen
El pronóstico actual y la clasificación de la Convención se basa en la puesta en escena de sistemas que se integran los hallazgos histopatológicos y clínicos. Sin embargo, en la mayoría de los casos de CCR, disfunción de las células es el resultado de numerosas mutaciones que modifican la expresión de proteínas y modificaciones post-traduccionales 1.
Una serie de antígenos de superficie celular, incluyendo cluster de diferenciación (CD) antígenos, han sido identificados como potenciales de pronóstico o marcadores metastásicos en el CCR. Estos antígenos hacer biomarcadores ideal como su expresión cambia a menudo con la progresión del tumor o interacciones con otros tipos de células, como linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) y los macrófagos asociados al tumor (TAM).
El uso de la inmunohistoquímica (IHC) para el cáncer de sub-clasificación y el pronóstico está bien establecido para algunos tipos de tumores 2,3. Sin embargo, no solo "marcador" ha demostrado importancia pronóstica superior clínico-patológicas de ensayo o de ganado amplia aceptación para su uso en la presentación de informes de rutina de todos los casos la patología CRC.
Un enfoque más reciente de la estratificación pronóstica de los fenotipos de la enfermedad se basa en los perfiles de proteínas de superficie con varios "marcadores". Mientras que los perfiles de expresión de los tumores mediante técnicas proteómicas como iTRAQ es una poderosa herramienta para el descubrimiento de biomarkers4, no es el óptimo para su uso rutinario en los laboratorios de diagnóstico y no se pueden distinguir diferentes tipos de células en una población mixta. Además, grandes cantidades de tejido tumoral se requieren para la elaboración de perfiles de las glicoproteínas de la membrana plasmática purificada por estos métodos.
En este video se describe un método simple para crear perfiles de la superficie del proteoma de células viables de muestras desglosados CRC utilizando un microarray de anticuerpos DotScan CRC. Los microarrays 122-anticuerpo consiste en un estándar de 82-anticuerpo reconoce una amplia región del linaje de los marcadores específicos de leucocitos, las moléculas de adhesión, los receptores y los marcadores de inflamación y respuesta inmune 5, junto con una región por satélite para la detección de 40 marcadores potencialmente pronóstico de CRC . Las células son capturados sólo en los anticuerpos para los que expresan el antígeno correspondiente. La densidad de las células por punto, determinado por lectura óptica, refleja la proporción de células que expresan ese antígeno, el nivel de expresión del antígeno y la afinidad de los anticuerpos 6.
Para el tejido de la Convención o en la mucosa intestinal normal, las exploraciones ópticas reflejan el inmunofenotipo de la población mixta de células. Multiplexación de fluorescencia se puede utilizar con el perfil seleccionado sub-poblaciones de células de interés capturado en la matriz. Por ejemplo, Alexa molécula de adhesión celular 647-anti-epiteliales (EpCAM, CD326), es un antígeno de diferenciación pan-epiteliales que se usa para detectar células CRC y también las células epiteliales de la mucosa intestinal normal, mientras que ficoeritrina anti-CD3, se utilizó para detectar la infiltración de células T 7. El CRC DotScan microarrays debe ser el prototipo de una alternativa de diagnóstico para el sistema de clasificación anatómica basada en CRC.
Protocolo
Figura 1. Flujo de trabajo para la preparación de una suspensión de células vivas de una muestra quirúrgica del CRC.
1. Desagregación de la muestra clínica
Todas las muestras fueron recolectadas en el Hospital Royal Prince Alfred (Camperdown, NSW, Australia) y el Hospital Concord de Repatriación (Concord West, NSW, Australia) con el consentimiento informado en el Protocolo N º X08-164.
- Recoger el cáncer fresco colorrectal (CCR) o muestras ....
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Discusión
En este video, que demuestran cómo los microarrays de anticuerpos DotScan se puede utilizar en una forma simple, semi-cuantitativo de manera de estudiar los perfiles de antígeno de superficie de las poblaciones de células del tejido CRC.
La obtención de una suspensión de células viables solo a partir de tejido es esencial para el éxito del experimento, ya que depende de la energía los procesos (por ejemplo, el antígeno de recubrimiento y / o la formación de pseudópodos) parecen ser necesario.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Damos las gracias al personal del Anatómico laboratorios de patología de la Royal Prince Alfred y Hospitales de Concordia repatriación de recogida de muestras frescas de la CRC y la mucosa intestinal normal. El trabajo fue financiado por una beca del Instituto del Cáncer de Nueva Gales del Sur Programa traslacional.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo o equipo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Solución salina balanceada de Hanks | Sigma-Aldrich | H6136-10X1L | Tamponado con Hepes 25 mM (Sigma # H3375) |
| Airpure gabinete de seguridad biológica de clase II | Westinghouse | 1687-2340/612 | |
| Hojas de bisturí | Livingstone | 090609 | Paquete de 100 |
| RPMI 1640 con 2 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R4130-10X1L | |
| Colagenasa tipo 4 | Worthington | 4188 | |
| Desoxirribonucleasa 1 | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Terumo jeringa (10 ml) | Terumo | SS 10 L | Caja de 100 |
| Filcon filtro (200 m) | BD Biosciences | 340615 | |
| Filcon filtro (50 micras) | Filcon filtro (50 micras) | Filcon filtro (50 micras) Filcon filtro (50 micras) y 340.603 | |
| Suero fetal bovino | Gibco / Invitrogen | 10099-141 | |
| Centrífuga 5810 R | Eppendorf | 7017 | |
| Dimetilsulfóxido | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| El azul tripán | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Hemocymeter Technocolor Neubar | Hirschmann | no está disponible | |
| Microscopio de luz | Nikon | Nikon TMS | |
| Tubos Cyrovial | Greiner Bio-One | 121278 | |
| Cryo contrainer congelación | Nalgene | 5100-0001 | |
| DotScan anticuerpos microarrays kit | Medsaic | no está disponible | |
| DotScan microarrays bandeja de lavado | Medsaic | no está disponible | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 4103 | |
| Formaldehído 37% | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | |
| DotReaderTM | Medsaic | no está disponible | |
| Albúmina de suero bovino | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Inactivado por calor suero AB 2% | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoeritrina conjugado CD3 | Beckman Coulter | ET386 | |
| AlexaFluor647 conjugado EpCAM | BioLegend | 324212 | |
| Tifón FLA 9000 | GE Healthcare | 28-9558-08 | 532 nm láser, 580 BP30 emisión de filtro para el PE. 633 nm láser y 670 BP30 emisión de filtro para Alexa647 |
| Multiexperiment Visor v4.4 | TM4 Microarrays Software Suite | Abierto - el software de código (Ref 11) |
Referencias
- Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer. Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297(2002).
- Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D.
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing
Posted by JoVE Editors on 7/03/2015. Citeable Link.
The author's email has been corrected in the publication of Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
j.zhou@uws.edu.au
from:
jzho7551@mail.usyd.edu.au
