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Control de la ubiquitina-proteasoma actividad en las células vivas utilizando un degron (dgn)-desestabilizado la proteína verde fluorescente (GFP)-basada en proteína indicadora

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DOI:

10.3791/3327

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10 de noviembre de 2012

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1Molecular and Cell Biology, Institute for Biomedical Aging Research, 2Department of Gerontology and Geriatrics, Netherlands Consortium for Healthy Aging, Leiden University Medical Center

En este artículo

Resumen

Un método para supervisar la actividad de ubiquitina-proteasoma en células vivas se describe. Un degron-GFP desestabilizado-(GFP-dgn) y una estable GFP-dgnFS proteína de fusión se generan y se transduce en la célula usando un vector de expresión lentiviral. Esta técnica permite generar un GFP-dgn/GFP-dgnFS estable línea celular que expresa en la que se puede ubiquitina-proteasoma actividad fácilmente evaluada utilizando epifluorescencia o citometría de flujo.

Resumen

Proteasoma es el principal organelo intracelular implicada en la degradación proteolítica de proteínas anormales, mal dobladas, dañadas u oxidadas 1, 2. El mantenimiento de la actividad del proteasoma fue implicado en muchos procesos celulares clave, como respuesta al estrés celular 3, la regulación del ciclo celular y la diferenciación celular 4 o en la respuesta del sistema inmune 5. La disfunción del sistema ubiquitina-proteasoma se ha relacionado con el desarrollo de tumores y enfermedades neurodegenerativas 4, 6. Además, una disminución en la actividad del proteasoma se encontró como una característica de la senescencia celular y el envejecimiento organismal 7, 8, 9, 10. A continuación, se presenta un método para medir la actividad ubiquitina-proteasoma en células vivas utilizando una proteína de fusión GFP-dgn. Para ser capaz de controlar la actividad de la ubiquitina-proteasoma en células vivas primarias, ADN complementario construye codifica para una proteína fluorescente verde (GFP)-dgn proteína de fusión (GFP-dgn, inestable) y una variante con una mutación de desplazamiento de marco (GFP-dgnFS, estable 11) se insertan en vectores de expresión lentiviral. Se prefiere esta técnica sobre técnicas de transfección tradicionales, ya que garantiza una eficacia de transfección muy alta independiente del tipo de célula o de la edad del donante. La diferencia entre la fluorescencia mostrada por el GFP-dgnFS (estable) de proteína y la proteína de desestabilizado (GFP-dgn) en ausencia o presencia de inhibidor del proteasoma puede ser utilizado para estimar la ubiquitina-proteasoma actividad en cada cepa de célula particular. Estas diferencias pueden ser supervisado por microscopía de epifluorescencia o puede ser medido por citometría de flujo.

Protocolo

1. Construcción de plásmidos

  1. Orden de ratón oligo-nucleótidos que codifica para dgn (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) y para dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) y ligarlo en el vector pEGFP-C1 para obtener la fusión de la GFP con dgn / dgnFS (Figura 1).
  2. Amplificar la secuencia codificante de GFP y GFP-dgn dgnFS-por PCR de acuerdo con el protocolo del kit de clonación pENTR Directional TOPO y continuar con la pLenti6/V5 direccional TOPO Cloning Kit (Figura 6).

2. Virus Producción

  1. El día antes de la transfección (Día 1) semilla fuera HEK 293FT células en unos frascos T75 para que puedan ser 90-95% de confluencia en el día de la transfección.
  2. En el día de la transfección diluir 36 l de Lipofectamine 2000 reactivo en 1,5 ml de DMEM sin suero y antibióticos en un falcon de 15 ml. Utilice otro Falcon de 15 ml y diluir 3 mg pLenti6/V5 que lleva el ADN complementario, ya sea para la construcción de buenas prácticas agrarias -Dgn o GFP-dgnFS, 2,5 g envolvente pMD2.G plásmido que codifica y 7,5 g psPAX2 esqueleto del vector en 1,5 ml de DMEM sin suero y antibióticos. Después de 5 min el ADN diluido se combina con la solución diluida de reactivos Lipofectamine 2000.
  3. Incubar la mezcla durante 20 min a temperatura ambiente para permitir que los complejos de ADN-lipofectamina a forma.
  4. Retire el medio de las células HEK 293FT, reemplácelo con cuidado por 7 ml de medio (sin antibióticos) y se añade la mezcla de ADN-lipofectamina al matraz y roca hacia adelante y atrás para mezclar (Día 2). Incubar el frasco durante la noche a 37 ° C en un humidificado 5% de CO 2 incubadora.
  5. Cambio de medio el día siguiente (10 ml de medio sin antibióticos; Día 3).
  6. Después de 48 horas (día 5) cosecha sobrenadante, centrifugar a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente y se filtra el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 micras PVDF.

Medio de cultivo - DMEM (HEK 293FT)

tienda de campaña "> DMEM
FBS 10%
0,1 mM MEM NEAA
6 mM de L-glutamina
1 mM de piruvato sódico MEM
1% de Pen-Strep (opcional)
500 g / ml de geneticina (opcional)

3. Virus Concentración por polietilenglicol (PEG) Precipitación

  1. Añadir una solución de glicol de polietileno volumen (50 Polietilenglicol mM, 41 mM NaCl, autoclave, pH = 7,2; PEG) a cuatro volúmenes de sobrenadante y se incuba durante 2 horas a 4 ° C. Con cuidado, se mezcla cada 20-30 minutos por inversión.
  2. Centrifugue a 1500 xg durante 30 min a 4 ° C. Una bola blanca debe ser visible.
  3. Aspirar el sobrenadante y se centrifuga de nuevo a 1500 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar la solución de PEG restante.
  4. Resuspender el sedimento en medio o tampón fosfato salino (PBS) pipeteando arriba y abajo y vigorosamente vórtice durante 20 a 30 segundos. Como una guía para utilizar 500 l un matraz T75 y alícuota a 100 l. Almacenar el virus a -80 ° C.

  1. Semilla fuera 5 × 10 4 U2-OS células a cada pocillo de una placa de 6-y el día antes de la transfección.
  2. En el día de la transfección eliminar el medio de cultivo y sustituirla por 1 ml de DMEM que contenía 8 g / ml de polibreno (bromuro de hexadimetrina). Diluir el virus concentrado sobrenadante 1:10 y 1:100 y añadir 1 l cada uno a un pocillo. Para concentraciones más altas de virus usan 1 l, l 5 y 10 l de sobrenadante de virus concentrada para los pocillos restantes. Uno bien se deja como un control positivo.
  3. El día siguiente sustituir el medio por 2 ml de DMEM.
  4. Comienza con la selección del día siguiente. Aplicar 10 g / ml blasticidina en cada pocillo. Sustituya el medio que contiene antibiótico cada dos días.
  5. Aproximadamente 6-7 días después de comenzar la selección de las células no transducidas están muertos. Para la tinción de lavar las células tres veces con PBS y se cubren las células con violeta cristal (10 mg / l de violeta cristalen 20% de etanol) y se incuba durante 5-10 min a temperatura ambiente. Aspirado de cristal violeta (puede ser reutilizado varias veces) y enjuagar los pocillos dos veces con ddH 2 O y secar la placa.
  6. Contar las colonias y se multiplican con 1.000 y la dilución correspondiente (Figura 7). Este procedimiento permite calcular las unidades de transfección (TU) del virus / ml.

Medio de cultivo - DMEM (HFF-2/U2-OS)

DMEM
FBS 10%
6 mM L-glutamina
1% de Pen-Strep

5. Transducción de fibroblastos diploides humanos (Este procedimiento puede ser utilizado para cualquier tipo de célula.)

  1. Semilla fuera 5 × 10 4 fibroblastos diploides humanas (HDF) a 6-y las placas el día antes de la transducción.
  2. Utilice una multiplicidad de infección de dos junto con 8 mg / ml de polibreno como potenciador de la transducción en un total de un mililitro.
  3. Cambio de medio al día siguiente.
  4. ¿Cuándolas células están en un 70-80% de confluencia comienzo de la selección con 10 mg / ml de blasticidina. Después de completada la selección (sin células no transfectadas mueren más) la expansión de las células puede iniciar y las células están listas para experimentos. Selección crónica con blasticidina permite generar una línea celular estable que sobreexpresan GFP-dgn o GFP-dgnFS proteínas de fusión, listos para medir la actividad del proteasoma. Este procedimiento garantiza una eficacia de transfección muy alta independiente del tipo de células.

6. Medición por citometría de flujo

  1. Semilla out 1 × 10 5 células (ya sea en libros o GFP-dgn dgnFS GFP-) el día antes del experimento.
  2. Tratar las células de control de 3 horas antes de la medición con el inhibidor del proteasoma, por ejemplo, 100 mg / ml LLnL.
  3. Lavar dos veces con PBS y se cosechan las células usando 0,5 ml de tripsina. Para detener la tripsinización utilizar 4,5 ml de medio de cultivo y transferir las células a un Falcon de 15 ml.
  4. Girar tél las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
  5. Aspirar el medio, resuspender las células en PBS y centrifugar de nuevo a 300 xg durante 5 min a 37 ° C.
  6. Aspirar el PBS, resuspender en 400 l de tampón FACS (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl 2, pH = 7,4) y transferir las células a tubos de FACS.
  7. Mantener las células en muestras de hielo y medida por citometría de flujo. Las células no se deben almacenar más de 30 min a 4 ° C.

7. Los resultados representativos

La proteína de fusión GFP-dgn lleva una secuencia que se dirige al proteosoma y por lo tanto la proteína es degradada inmediatamente, sino que corresponde a la disminución de la señal de fluorescencia GFP. El mutante de desplazamiento de marco (GFP-dgnFS) lleva una versión mutada de esta secuencia y no es degradado por la proteasoma, sino que conduce a la mayor fluorescencia verde. Por estas razones, joven HDF con la actividad del proteasoma espera alta y transducidas con GFP-dgn muestran una baja (6% de células positivas) señal de fluorescencia en tanto la medición de citometría de flujo y en epifluorescencia (Figura 2A y B, Figura 3). Lo mismo HDF transduced con las buenas prácticas agrarias-dgnFS mostrar el 39,7% de las células positivas. El tratamiento de las células con inhibidor del proteasoma LLnL (N-acetil-L-leucil-L-leucil-L-norleucinal) planteó la señal hasta un máximo de 62,9% en ambos, GFP-dgn y GFP-dgnFS células (Figura 2A y B ).

Para determinar la posible disminución de la actividad del proteasoma en edades comprendidas entre muestras de piel humana, los fibroblastos dérmicos aislados de donantes jóvenes, de mediana edad y ancianos fueron infectadas con GFP y GFP-dgn dgnFS, como se ha descrito anteriormente y se cultiva en el número mismo pasaje antes del análisis por flujo citometría. En estos experimentos, un aumento claro en la señal de GFP entre individuos jóvenes (11,2 ± 0,88% células GFP-positivas) y de mediana edad donantes (20,4 ± 2,27% de opiniones positivas GFP-células, p = 0,003) se ha observado, lo que indica una disminuir en proteasome actividad en las muestras obtenidas de donantes de edad 7 (Figura 4). No mayor disminución en la actividad del proteasoma se observó en fibroblastos aislados de individuos de más edad (Figura 4). La intensidad de fluorescencia de GFP-dgnFS era en todos los casos ~ 90% (datos no mostrados) lo que indica una alta eficiencia de transfección de los tres diferentes grupos de edad.

Figura 1
Figura 1. La secuencia GFP y GFP-dgn dgnFS-. Muestra es el extremo 3 'de GFP (verde) el sitio de clonación múltiple del vector pEGFP-CL1 (gris) y la secuencia de dgn / dgnFS (rojo).

Figura 2
Figura 2. Análisis de citometría de flujo de las buenas prácticas agrarias y las buenas prácticas agrarias-dgn dgnFS fibroblastos diploides humanos. A. fibroblastos jóvenes de prepucio humano (HFF-2) fueron infectadas con vectores lentivirales que transportan una proteína fluorescente verde (GFP)-dgn gen o un dgnFS GFP-(frameshift) construir, como se indica y se analizaron para la fluorescencia de GFP mediante citometría de flujo (FACS Canto II, Becton Dickinson). Donde se indique, las células se trataron también durante 3 h con inhibidor del proteasoma N-acetil-L-leucil-L-leucil-L-norleucinal (LLNL). Las células no infectadas se utilizaron como control. Los experimentos se realizaron por triplicado. B. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Los números reflejan la cantidad de células GFP positivas. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 3
Figura 3. Análisis de microscopía de fluorescencia de GFP y GFP-dgn-dgnFS células HFF-2. Joven HFF-2 fueron tratados como en la Figura 2. A los 9 días después de la infección, las células fueron visualized por fluorescencia y microscopía de contraste de fase.

Figura 4
Figura 4. Los cambios en la actividad del proteasoma en el envejecimiento de la piel humana. Los fibroblastos de prepucio humano de nueve donantes diferentes en los grupos de edad indicados se expandieron mínimamente y se infectaron con constructos de lentivirus que codifican para GFP-DGN. A los 9 días después de la infección, las células fueron analizadas por citometría de flujo. Los datos se obtuvieron en tres muestras por grupo de edad por duplicado (± SE).

Figura 5
Figura 5. Enfoque experimental. Custom-oligo nucleótidos para dgn y dgnFS se clonan en el vector pEGFP-C1 y los virus se producen para cada constructo utilizando células HEK 293FT. El título de los virus se determina. Las células son transducidas con el virus y expandido. Después de que el trato de favor que las células se analizanpara la señal de fluorescencia por citometría de flujo.

Figura 6
Figura 6. Mapa de Plenti GFP-dgn. El mapa del pLenti6/V5-DEST vector que incluye la secuencia de GFP-dgn se muestra. Abreviaturas: pCMV (promotor CMV), GFP-dgn (secuencia de GFP-dgn), P SV40 (SV40 promotor temprano), EM7 (EM7 promotor), blasticidina (gen blasticidina resistencia), ΔU3 / LTR 3 '(3' LTR con eliminada región U3), pA SV40 (SV40 señal de poliadenilación), ampicilina (gen de resistencia a ampicilina), pUC ori (origen de pUC), PRSV / LTR en 5 '(RSV / LTR 5' promotor híbrido), Ψ (VIH-1 señal de empaquetamiento Ψ ), RRE (VIH-1 elemento de respuesta a Rev).

Figura 7
Figura 7. U2-OS placa de titulación. U2-OS se sembraron sobre una placa de 6 pocillos y se transfectaron con diferentes concentraciones de virus (dilución de 1/100 y 1/10, 1, 5 y 10 l de concentrated sobrenadante viral). Un pozo se utilizó como control no transfectadas (NT). Después de 6-7 días, las células se tiñeron con cristal violeta y se secaron al aire.

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Discusión

La primera publicación utilizando la proteína fluorescente verde (GFP) como sustrato reportero de ubiquitina-proteasoma actividad se publicó en 2000 12. Desde entonces, GFP se ha convertido en una herramienta común para visualizar las actividades celulares, especialmente el proceso de ubiquitina-proteasoma. Para supervisar la ubiquitina-proteasoma actividad in vivo de un modelo de ratón transgénico con un reportero GFP basada ha introducido 13. Adicional a la investigación in ...

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Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por: Red Nacional de Investigación sobre el Envejecimiento (NFN S93) por la Fundación de Ciencias de Austria (FMF), Comisión Europea Integrada de Proyectos y MiMAGE PROTEOMAGE, Países Bajos Genómica Iniciativa / Organización Neerlandesa para la Investigación Científica (IGN / NWO, 05040202 y 050 - 060-810 NCHA), financiado por la UE Red de Excelencia Duración (6 º PM 036.894) y el Programa de Innovación Tecnológica Orientada sobre Genómica (SenterNovem; IGE01014 y IGE5007).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo
pEGFP-C1 Vector BD Bioscience Clontech 6084-1
pENTR Directional TOPO Cloning Kit Invitrogen K2400-20
pLenti6/V5 direccional TOPO Cloning Kit Invitrogen V496-10
Lipofectamine 2000 Reactivo Invitrogen 11668019
DMEM Sigma D5546
PVDF filtro (Rotilabo-Spritzenfilter) Roth P667.1
Polietileno glicol Sigma P2139
NaCl Merck 1.06404.1000
Fosfato de Dulbecco tamponada Saline 1x (PBS) Invitrogen 14190
hexadimetrina bromuro Sigma 10,768-9
Blasticidina Invitrogen R21001
El cristal violeta Sigma C3886
FACS tubos BD Biosciences
La penicilina estreptomicina (Pen-Strep) Invitrogen 15140130
L-glutamina 200 mM Invitrogen 25030024
Suero bovino fetal (FBS) Biochrom AG S0115
MEM no aminoácidos esenciales (AANE) 100x Invitrogen 11140035
MEM piruvato sódico 100 mM Invitrogen 11360039
D-(+)-glucosa (45%) Sigma G8769
Geneticina Invitrogen 11811023
CaCl2 Merck C5080
Hepes Sigma H3375
Tripsina-EDTA (0,05%) Invitrogen 25300054

Referencias

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