El análisis de la migración de células troncales neurales Crest utilizando una versión modificada del ensayo Zigmond Cámara

Resumen

Un enfoque para analizar la migración de las células explantados (células troncales de la cresta neural) se describe. Este método es barato, amable y capaz de distinguir la quimiotaxis de los dos quimiocinesis y otras influencias en la polaridad migratorias, como las derivadas de las interacciones célula-célula en el tronco principal cultivo de células neuronales de la cresta.

Resumen

Las células de la cresta neural (CCN) son una población transitoria de células presentes en el desarrollo de vertebrados que emigrar del tubo neural dorsal (NT) tras someterse a un ^1,2 transición epitelio-mesenquimal. Después de la EMT, los países contribuyentes netos migrar grandes distancias a lo largo de las vías estereotipados hasta alcanzar sus objetivos. NCC diferenciarse en una amplia gama de tipos de células incluyendo neuronas, células gliales, los melanocitos, células cromafines y ^1-3. La capacidad de los países contribuyentes netos para alcanzar y reconocer a sus lugares de destino adecuado es fundamental para la formación adecuada de todas las estructuras que contienen tronco NCC componentes derivados ^3. Elucidar los mecanismos de orientación para el tronco NCC migración ha sido por lo tanto, una cuestión de gran importancia. Numerosas moléculas se ha demostrado que guía la migración NCC ^4. Por ejemplo, los países contribuyentes netos tronco se sabe que son repelidos por las señales negativas como la orientación semaforina, efrina, y ligandos de hendidura ^5-8. Sin embargo, nohasta hace poco cualquier quimiotácticos de los países contribuyentes netos tronco se han identificado ^9.

Convencionales métodos in vitro para estudiar el comportamiento quimiotáctico de células adherentes mejor trabajar con inmortalizado, las células homogéneamente distribuidos, pero son más difíciles de aplicar a ciertos cultivos primarios de células madre que inicialmente carecen de una distribución homogénea y diferenciar rápidamente (por ejemplo, los países contribuyentes netos). Un enfoque para homogeneizar la distribución de los países contribuyentes netos del tronco de los estudios de quimiotaxis es aislar a los países contribuyentes netos tronco de cultivos primarios de explantes NT, a continuación, levante y replate a ser casi el 100% confluente. Sin embargo, este enfoque requiere de placas grandes cantidades de tiempo y esfuerzo para explante número suficiente de células, es duro, y distribuye los países contribuyentes netos del tronco de una manera diferente a la que se encuentra en condiciones in vivo.

Aquí, se presenta un enfoque in vitro que es capaz de evaluar la quimiotaxis y otras respuestas migratorias de los países contribuyentes netos tronco sin requiringa la distribución de células homogéneas. Esta técnica utiliza imágenes a intervalos de tiempo de la primaria, imperturbable NCC tronco dentro de una cámara modificada Zigmond (una cámara estándar de Zigmond se describe en otro ^10). Mediante la exposición de los países contribuyentes netos del tronco en la periferia de la cultura a un gradiente de chemotactant que es perpendicular a su direccionalidad predijo naturales, las alteraciones en la polaridad migratorios inducidos por el gradiente de chemotactant aplicada puede ser detectado. Esta técnica es de bajo costo, requiere el cultivo de sólo dos explantes por tratamiento NT replicar, evita la elevación de células duras (por ejemplo, tripsina), las hojas de los países contribuyentes netos tronco en una distribución más similar a las condiciones in vivo, reduce la cantidad de tiempo que transcurre entre la explantación y la experimentación (lo que probablemente reduce el riesgo de diferenciación), y permite lapso de tiempo la evaluación de numerosas características migratorias.

Protocolo

1. Día 1: El aislamiento de los tubos neurales del tronco de la cultura durante la noche en cubreobjetos

1. Huevos se incuban chica de 56 horas a 38 ° C. Retire los huevos de incubación, rociar ligeramente con el 70% de etanol, y luego dejar que se sequen. Rompa los huevos se abren en una bandeja de vidrio UV-esterilizados.
2. Extracto de cada embrión de su yema y colocarlo en chica de Ringer. Para ello, el primer corte en torno a las islas de sangre con tijeras curvas, y luego, con una pinza roma, elegir el embrión por la membrana extraembrionarias y colocarlo en una placa de Petri estéril de plástico que contiene la solución de Ringer chica.

Discusión

La realización de investigaciones sobre la quimiotaxis de los países contribuyentes netos tronco ha demostrado ser un reto para una serie de razones. NCC tronco constituyen una población heterogénea de células madre que va a diferenciar si se cultivan a largo plazo, por lo tanto, los países contribuyentes netos tronco ha de ser obtenida de la explantación de la primaria del tronco a nivel de NT. Los métodos convencionales para estudiar la respuesta quimiotáctica de las poblaciones de células distribuidas homogéneamente .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
DMEM	Omega Científico	DM-22
Solución de penicilina estreptomicina	Omega Científico	PS-20	Concentración de 100X
L-glutamina	Omega Científico	GS-60	Concentración de 100X
El suero fetal bovino	Omega Científico	FB-11	Lote # 105247 (o cualquier otro que sea comparable)
Modificado Zigmond cámara	Hecho en casa	N / A	Volumen de embalse: 160 ~ ea l, para obtener especificaciones adicionales, ver fig. 4 y el protocolo adicional de fabricación
Placa de cultivo celular	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronectina	BD	354008	Foto 10 veces más preparada mediante la dilución de 1 mg FN en 1 ml de H 2 O y 9 ml DMEM
Cubreobjetos	Pescador	12-548-B	Precleaned, 22 x 22 mm
L15	Thermo Scientific	SH30525.02
Jalea de petróleo	Comodidades	011110794642	100%
Tubo de centrífuga	Biologix	10-9152	15 ml
Dispasa	Sistemas de Celdas de	4Z0-850	Concentración de 10X
Jeringa	BD	309602	1 ml
Aguja	BD	305127	25 G x 1,5 pulgadas
Alexa Fluor 488-IgM	Yonvitrogen	A21042	Archivo es de 2 mg / ml, 7 moles tinte / mol IgM
Pinza de disección	FST	Misc.	Dumont n º 5 o el 55, con punta recta, acero inoxidable o titanio
Aguja de tungsteno	N / A	N / A	Hecho en casa, coloca en un soporte de pasador
Blunt Forceps	Tiemann	160-18	Se utiliza para transferir los embriones al Ringer de yema de huevo

Protocolo Suplementario: Fabricación de una cámara modificada Zigmond

Por favor refiérase a la Figura 4 como referencia para el protocolo siguiente:

1. Compra de una hoja de 3 / 16 "de espesor de acrílico pulido (4,45 mm de espesor real).
2. Utilizando una sierra de mesa, cortar los espacios en blanco cámara de gran tamaño a las dimensiones aproximada de 33,25 mm x 64,57 mm. Esto permite a los 3.175 mm de material adicional para el mecanizado.
3. Set en blanco en una cámara de vise. Con una fresadora y un 6,35 mm (1 / 4 ") poco la fresa, el acabado de mecanizado de los lados de la cámara a sus dimensiones exactas: 30,07 mm x 61,39 mm.
4. La posición de la cámara en blanco en la máquina de fresado y localizar el centro del blanco a lo largo de los dos ejes X e Y con un palpador de aristas, y luego a cero la ubicación del centro.
5. Adquirir la altura de la cámara (eje Z) al tocar la fresa final a la superficie superior y el cero de la altura.
6. El uso de un 3,91 mm (0,154 ") poco la fresa, compensar el poco 3,03 mm a lo largo del eje X (dirección positiva) para el primer depósito. Comienza de mecanizado en la cámara hasta una profundidad de 2,84 mm mientras que se mueve a lo largo del eje Y ( dirección positiva) de 7,62 mm (0,300 ") y luego atravesar a 7,62 mm (0,300") en la dirección opuesta (negativa) en dirección a una longitud total de embalse de 15,24 mm (0,600 "). Compensar el poco a 3,03 mm (0,119 ") a lo largo del eje X (sentido negativo) y repetir el mismo proceso para el segundo depósito.
7. Posición de la cámara en su extremoy hacer un agujero con un 1,09 mm (0,043 pulgadas) broca en el extremo de cada depósito (4 en total) que conecta el extremo del depósito al lado de la cámara de carga media durante la experimentación.
8. Sumerja la cámara bien en agua tibia y jabón para ayudar a eliminar todos los contaminantes químicos.
9. Remojo y enjuague la cámara bien en agua doblemente destilada para eliminar todo el jabón. Las cámaras están ahora listos para su uso como se describió anteriormente.