Multiplex detección de bacterias en el complejo de muestras clínicas y ambientales utilizando oligonucleótidos de acoplamiento de microesferas fluorescentes

Summary

Se describe un método multiplex para la detección de microorganismos en una muestra utilizando oligonucleótidos junto perlas fluorescentes. Amplificación de todos los organismos dentro de una muestra se hibridó con un panel de cuentas, junto sonda. Un instrumento Luminex o Bio-Plex se utiliza para consultar cada cuenta para el tipo de cuentas y la señal de hibridación.

Abstract

La vaginosis bacteriana (VB) es un síndrome recurrente polimicrobiana que se caracteriza por un cambio en la "normal" microbiota de Lactobacillus dominado por una microbiota dominado por una serie de especies bacterianas, incluyendo Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginas, y ^3.1 los demás. Esta condición se asocia con una serie de resultados negativos para la salud, incluyendo la adquisición del VIH ^4, y puede ser difícil de manejar clínicamente ^5. Además, el diagnóstico de vaginosis bacteriana se ha basado en el uso de la tinción de Gram de los frotis de hisopado vaginal que se califican en diversos criterios numéricos ^6,7. Si bien este diagnóstico es sencillo, barato y bien adaptado a entornos con recursos limitados, que pueden sufrir de problemas relacionados con las interpretaciones subjetivas y no le da un perfil detallado de la composición de la microbiota vaginal ^8. Los recientes esfuerzos de secuenciación profunda han revelado una microbiota rico, diverso, con la vaginaclaras diferencias entre las muestras tomadas de las personas que son diagnosticadas con BV en comparación con los individuos que se consideran normales ^9,10, lo que ha dado como resultado la identificación de una serie de posibles objetivos para el diagnóstico molecular de la BV ^11,12. Estos estudios han proporcionado una gran cantidad de información útil, pero la secuencia no es profundo y práctico como un método de diagnóstico en un entorno clínico. Recientemente hemos descrito un método para rápidamente el perfil de la microbiota vaginal en un formato multiplex utilizando oligonucleótidos, junto con la detección de perlas fluorescentes en una plataforma Luminex ^13. Este método, como el actual la tinción de Gram basada en métodos, es rápido y sencillo, pero añade la ventaja adicional de la explotación del conocimiento molecular derivados de estudios de secuenciación en el diseño de la sonda. Por lo tanto, este método proporciona una forma de perfil de los microorganismos más importantes que están presentes en una muestra vaginal que se puede utilizar para diagnosticar BV con una alta especificidad y sensibilidad de un borradorared con tinción de Gram, mientras que el suministro de información adicional sobre la presencia y abundancia de especies de una manera semi-cuantitativa y rápida. Este método múltiple se puede ampliar mucho más allá del alcance de los actuales ensayos de PCR cuantitativa a organismos particulares, que actualmente se limita a 5 ó 6 pruebas diferentes en una sola muestra ^14. Es importante destacar que el método no se limita a la detección de bacterias en muestras vaginales y pueden ser fácilmente adaptados al perfil rápidamente casi cualquier comunidad microbiana de interés. Por ejemplo, recientemente hemos comenzado a aplicar esta metodología para el desarrollo de herramientas de diagnóstico para su uso en plantas de tratamiento de aguas residuales.

Protocol

Este método fue utilizado en la investigación publicada en Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

Un diagrama esquemático que representa el procedimiento general se presenta en la Figura 1.

1. Bolas de acoplamiento

Esto describe los métodos que se utilizan para el acoplamiento de sondas de oligonucleótidos de poliestireno cuentas Luminex (ver Tabla 2). Los volúmenes se adaptó ligeramente para la evaluación de nuevas sondas de captura a modo de prueba, estos volúmenes se indican entre paréntesis.

1. Retire 1-etil-3-(3....

Discussion

La especificidad de la generación de la señal es de suma importancia, usted debe estar seguro de que la señal observada refleja realmente la detección de amplificación generados a partir de ese organismo. Software como PrimerPlex (Premier Biosoft) pueden ayudar a diseñar las sondas que se hibridan de manera eficiente, pero puede o no hibridizan a las especies no objetivo. Cuando universal de PCR se utilizan como se describe en este protocolo, es importante tener en cuenta que la amplificación generada representa a todos.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre de oligonucleótidos	Empresa	Secuencia de un
H279BP	Invitrogen, IDT, u otros	Biotina-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC
H280		YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT
H1612BP		Biotina-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC
H1613		CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT
1O, fosforotioato-C, E, G-fosforotioato; F, fosforotioato-A, I, inosina, Y, C y T, R, A o G, K, T, G, S, C o G.

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1-etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimida HCl (EDC)	Atravesar	22980
Bolas fluorescentes de poliestireno: Microplex microesferas (Luminex), o Bio-Plex COOH bolas (Bio-Rad)	Luminex o Bio-Rad	Bio-Rad: 171-506xxx donde xxx corresponde a la identificación de cuentas	Partículas magnéticas se están haciendo disponibles para el acoplamiento de oligonucleótidos y pueden ofrecer ciertas ventajas. No han sido juzgados por estos autores.
Oligonucleótidos de captura (5 'amino modificado C12)	Invitrogen, IDT, u otros	diferentes	Nivel de pureza desalada es aceptable. Secuencias de las sondas de captura utilizado para caracterizar muestras vaginales se proporcionan en el manuscrito en el que se basa este protocolo 13.
T7exonucleasa	New England Biolabs	M0263S
Estreptavidina-R-ficoeritrina (SA-PE)	Invitrogen	S-866	Tenga cuidado para obtener alta pureza SA-PE, este número de catálogo se recomienda
Vaina 96 y placas de PCR	Pescador	CS006509	encajaban en ambas termociclador de 96 pozos y la máquina BioPlex
Vaina de sellado alfombra	Pescador	CS006555	Puede ser reutilizado, lavar con agua jabonosa, enjuague bien y seque
TMAC 5M	Sigma	T3411
Bio-Plex o instrumento Luminex	Bio-Rad o Luminex	Bio-Rad: 171-000201
PrimerPlex software de diseño de la sonda	Premier Biosoft	www.premierbiosoft.com	Sugerido para la sonda de Luminexsigno, aunque otras plataformas de software se puede utilizar

componente	l / ensayo	ensayos μl/100	concentración final
10x PCR buffer (Invitrogen)	5	500	1x
50 mM MgCl 2 (Invitrogen)	2.5	250	2,5 mM
10 mM dNTP	1	100	0,2 mM de cada uno
H279BP, 25 M	0.25	25	375 nM
H1612BP, 25 M	0.75	75	125 nM
H280, 25 M	0.25	25	375 nM
H1613,25 M	0.75	75	125 nM
De agua	34	3400	---
Totales	44.5	4450