La visualización de Caenorhabditis Elegans Estructuras de la cutícula uso del colorante lipofílico Vital, DII

Summary

Se presenta un método para visualizar la cutícula en vivo C. elegans Con el fluorescente de color rojo lipofílico DII colorante (1,1 '-dioctadecil-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato), que se utiliza comúnmente en C. elegans Para visualizar las neuronas el medio ambiente expuestos. Con este protocolo optimizado, las estructuras de alas y de anular la cutícula están manchadas por el DII y observó mediante microscopía de compuesto.

Abstract

La cutícula de la C. elegans es una estructura muy resistente que rodea el exterior del animal ^1-4. La cutícula no sólo protege al animal del medio ambiente, sino que también determina la forma del cuerpo y juega un papel en la motilidad ^4-6. Varias capas secretada por las células epidérmicas forman la cutícula, que incluye una capa lipídica externa ^7.

Crestas circunferenciales en la cutícula del llamado patrón de anillos de la longitud del animal, y están presentes en todas las etapas de desarrollo ^8. Las alas son crestas longitudinales que están presentes durante las etapas específicas del desarrollo, incluyendo L1, Dauer, y adulto ^2,9. Las mutaciones en los genes que afectan a la organización del colágeno cuticular puede alterar la estructura de la cutícula y la morfología corporal del animal ^5,6,10,11. Mientras que imágenes cuticular mediante microscopía óptica compuesto con DIC es posible, métodos actuales que ponen de relieve las estructuras cuticulares son fluorescentesciento de expresión del transgen ^12, la tinción de anticuerpos ^13, y la microscopía electrónica ^1. Etiquetados aglutinina de germen de trigo (WGA) también se ha utilizado para visualizar las glicoproteínas cuticular, pero está limitado en la resolución de las estructuras más finas cuticular ^14. Tinción de la superficie de la cutícula con un tinte fluorescente se ha observado, pero nunca caracterizado en detalle ^15. Se presenta un método para visualizar la cutícula en vivo C. elegans con el fluorescente de color rojo lipofílico DII colorante (1,1 '-dioctadecil-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato), que se utiliza comúnmente en C. elegans para visualizar las neuronas el medio ambiente expuestos. Este protocolo optimizado para la tinción de Dii es un método simple y robusto para la visualización de alta resolución de anillos fluorescentes, las alas, la vulva, la cola masculina, y hermafroditas cola aumento en C. elegans.

Protocol

1. Preparación de DII mancha

1. Prepare una solución stock de 20 mg / ml DII (Biotium, Inc., Hayward, CA) en DMF. Dii es sensible a la luz, así que proteja DII de la luz, envolviendo en papel de aluminio.
2. Crear una dilución de trabajo de DII mediante la adición de 0,6 l de valores DII a 399,4 l M9 para cada población. Esto debería dar una dilución final de trabajo de 30 mg / ml en DII M9. Esto puede ser ampliado para la tinción de las poblaciones simultáneamente. Escudo de DII de la luz, envolviendo el tubo (s) en papel de aluminio.

2. Preparación de los nematodos

1. Use una placa de 60 mm con una población....

Discussion

El método de tinción DII que aquí se presenta permite una manera relativamente rápida y conveniente de visualizar la cutícula en C. elegans. Por reutilización y optimización de un método comúnmente utilizado para la imagen del medio ambiente expuestos neuronas sensoriales ^15,17, DII puede ser utilizado para teñir con fluorescencia tanto alas y estructuras anulares (Figuras 1 y 2), así como la vulva, la cola masculina, y hermafroditas cola pico (Figura 3). Hemos encontrado que la solución de incubació.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivos	Sinónimos	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dii	1,1 '-dioctadecil-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato	Biotium, Inc.	60010	Archivo de dilución: 20 mg / mL de DMF dilución de trabajo: 30 mg / ml
DMF	Dimetilformamida	Sigma-Aldrich, Inc.	D4551
Tritón X-100	Octylphenoxypolyethoxyethanol	VWR International, LLC.	EM-9410
M9	22mm KH 2 PO 4, 42 mm de Na 2 HPO 4, 86 mm NaCl, 1 mM MgSO 4
NGM	Nematodo medio de crecimiento	IPM Scientific, Inc.	11006-501	Se pueden preparar según el protocolo de NGM agar 18
Agar agar		EMD Chemicals, Inc.	1,01614	4% en agua
Levamisol	Levamisol clorhidrato	Sigma-Aldrich, Inc.	31742	100 mM - 1 mM levamisol como lo requiere
Portaobjetos de microscopio		VWR International, LLC.	16005-106
Gafas microscopio cubrir		VWR International, LLC.	16004-302
Compuesto alcance		Carl Zeiss, Inc.	A1m	Utilice los objetivos para satisfacer las necesidades del experimento
Filtro TRITC compatible u otro	Ynbsp;	Chroma Technology Corp.	49005	ET - DsRed (TRITC/Cy3) farfulló conjunto de filtros