Summary
यह लेख एक nanoprecipitation बहुलक आधारित diblock सह - पॉलिमर का उपयोग नैनोकणों synthesize विधि का वर्णन करता है. हम diblock सह पॉलिमर, nanoprecipitation तकनीक, और संभावित अनुप्रयोगों के संश्लेषण पर चर्चा करेंगे.
Protocol
1. PLGA-B-खूंटी बहुलक संश्लेषण
- (डी एल Lactide सह glycolide) टर्मिनल carboxylate समूहों के साथ पोलीफोनिक (PLGA) (PLGA carboxylate) PLGA (सामग्री अनुभाग में उल्लेख किया) के लिए किसी विलायक में 5mm की एक एकाग्रता में भंग कर रहा है. PLGA कोमल सरगर्मी के साथ इस एकाग्रता में भंग किया जा सकता है.
- दोनों एनएचएस (आणविक वजन 115.09) और EDC (आणविक वजन 191.7) PLGA समाधान में 25mm के एक एकाग्रता में भंग कर रहे हैं. (दोनों EDC और एनएचएस 5 बार एक stoichiometric PLGA करने के लिए तुलना में अधिक में जोड़ रहे हैं). PLGA carboxylate PLGA-एनएचएस में PLGA-carboxylate समाधान के बारे में 1 घंटे के लिए कोमल सरगर्मी के साथ EDC और एनएचएस जोड़कर बदल जाती है.
- प्रतिक्रिया उत्पाद PLGA-एनएचएस बाहर धोने के समाधान मेथनॉल जोड़कर उपजी है. लगभग 10 गुना मेथनॉल की मात्रा अधिक समाधान के लिए जोड़ा है. समाधान 2000 में centrifuged बाहर PLGA-एनएचएस वेग और सतह पर तैरनेवाला त्यागने (EDC और एन एच एस के निशान को हटा मेथनॉल से धोने की यह प्रक्रिया कम से कम तीन बार दोहराया है. XG.
- गोली PLGA-एनएचएस 30 मिनट धोने के समाधान के किसी भी अंश को हटाने के लिए एक वैक्यूम के तहत सूख रहा है.
- PLGA-एनएचएस गोली अब एक ही एकाग्रता है कि शुरू में इस्तेमाल किया गया था PLGA भंग ही विलायक में फिर से भंग है. heterobifunctional खूंटी (amine-खूंटी - carboxylate) तो 5mm की एक एकाग्रता में PLGA समाधान के लिए जोड़ा जाता है (1:1 के stoichiometric अनुपात). मिश्रण समाधान निरंतर क्रियाशीलता के साथ 24 घंटे के लिए incubated है.
- 24 घंटे के बाद, प्रतिक्रिया उत्पाद PLGA - ख - खूंटी ब्लॉक copolymer बाहर धोने में अतिरिक्त समाधान मेथनॉल जोड़कर उपजी है. धोने और centrifugation के रूप में तीन बार उपर्युक्त प्रक्रिया को दोहराएँ. यह सभी अतिरिक्त unreacted खूंटी निकाल देंगे.
- PLGA - ख - खूंटी ब्लॉक copolymer के तहत निर्वात सूख रहा है.
2. PLGA-ख खूंटी nanoparticle तैयारी
PLGA सतह पर खूंटी के साथ कवर कोर के साथ नैनोकणों इन diblock copolymers के साथ तैयार किया जा सकता है. विभिन्न hydrophobic दवाओं की एक किस्म ऐसी नैनोकणों में समझाया जा सकता है. प्रतिदीप्त यौगिकों नैनोकणों में समझाया जा सकता है या PLGA संयुग्मित और इस प्रकार इन नैनोकणों प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है किया जा सकता है.
Nanoprecipitation विधि नैनोकणों बनाने खासकर जब वांछित कार्गो के लिए समझाया जा प्रकृति में अत्यधिक hydrophobic है प्रयोग किया जाता है.
- PLGA - ख - खूंटी ब्लॉक copolymer और दवा / कार्गो (समझाया जा सकता है) किसी भी विलायक जो PLGA घुल में भंग कर रहे हैं. PLGA acetonitrile, डीसीएम, tetrahydrofuran, एसीटोन या एथिल एसीटेट सहित कई आम सॉल्वैंट्स, द्वारा भंग किया जा सकता है. विलायक के चुनाव महत्वपूर्ण है, के रूप में यह nanoparticle का गुणों को प्रभावित करती है. इसलिए, इस चरण में उपयुक्त विलायक इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- बहुलक / दवा मिश्रण फिर सरगर्मी पानी के 3-5 मात्रा आसपास मिलीग्राम / एमएल 3 के अंतिम बहुलक एकाग्रता देने के लिए है dropwise जोडी. (छवि 2)
- क्रियाशीलता कम दबाव के तहत 2 घंटे के लिए जारी रखा है नैनोकणों आत्म विधानसभा द्वारा फार्म करने के लिए अनुमति देते हैं और कार्बनिक विलायक के निशान हटाने.
- फसल काटने वाले और शुद्धि: नैनोकणों तो २,७०० एक्स छ पर 10 मिनट का उपयोग कर एक Amicon फिल्टर (20KDa MWCO), धोया के लिए centrifugation द्वारा केंद्रित कर रहे हैं, और PBS में पुनर्गठन . यह संयुक्त राष्ट्र फँस दवा / कार्गो निकालता है. मूल आकार के रूप में biophysical characterizations, सतह प्रभारी, और दवा लोड हो रहा है दक्षता के लिए बेहतर नैनोकणों के गुणों को समझने के लिए किया जा सकता है.
3. भंडारण
रुक सुखाने एक आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि 11 नैनोकणों की दुकान है . रुक सुखाने दीर्घकालिक स्थिरता के लिए 12 नैनोकणों के भौतिक और रासायनिक विशेषताओं की रक्षा करेंगे. फ्रीज सुखाने प्रक्रिया कणों पर तनाव का कारण और अस्थिर तैयार कर सकते हैं, तो (ठंड तनाव से सुरक्षा) क्रायो - protectants और lyo protectants (सुखाने तनाव से सुरक्षा) आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है है. इन protectants की पसंद का भंडारण समय के 13 वांछित लंबाई से निर्धारित होता है.
- फ्रीज सुखाने में, वहाँ अपने टीजी नीचे ठंड से नमूना की कुल solidification है.
- सुखाने चरण में, बर्फ उच्च बनाने की क्रिया के द्वारा हटा दिया जाता है. तापमान और दबाव के लिए एक कुशल फ्रीज सुखाने की प्रक्रिया को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
PLGA - ख - खूंटी डि ब्लॉक Copolymer की विशेषता
विभिन्न तकनीकों के लिए पॉलिमर के सफल संयुग्मन की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. PLGA-ख - खूंटी की संरचना एक 400 मेगाहर्ट्ज 1h के परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) का उपयोग लक्षण वर्णन किया जा सकता है. गठन उत्पाद के आण्विक वजन (PLGA-ख खूंटी) जेल पारगमन क्रोमैटोग्राफी (GPC) के द्वारा सत्यापित किया जा सकता है. PLGA - ख - खूंटी आणविक वजन distribution वक्र और क्षालन समय PLGA और खूंटी अकेले से अलग होना चाहिए. संयोजन में, इन तकनीकों का गठन उत्पाद विशेषताएँ और निर्धारित है कि संयुग्मन प्रतिक्रिया सफल रहा था चाहिए.
PLGA-ख खूंटी की विशेषता नैनोकणों
कण आकार और आकार वितरण गतिशील प्रकाश बिखरने से मापा जा सकता है. Nanoprecipitation प्रक्रिया में विभिन्न मापदंडों के कणों के आकार को प्रभावित करते हैं. शुरू में इस्तेमाल किया पॉलिमर (दोनों PLGA और खूंटी) के आण्विक वजन भी कण आकार के वितरण का प्रभाव. संक्रमण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) भी आकार और के रूप में 3 आकृति में देखा नैनोकणों के वितरण संरचना की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कण आकार सीमा एनएम रेंज में आम तौर पर है. असमान आकार के वितरण के साथ बड़े कण आकार या तो संयुग्मन प्रतिक्रिया या nanoprecipitation विधि की जरूरत है अनुकूलन में एक त्रुटि का संकेत सकता है. इसके अलावा, सतह जीटा संभावित ZetaPALS द्वारा मापा जा सकता है है.
लोड हो रहा है / दवा कार्गो दक्षता मानक HPLC के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.
कणों जैविक विलायक और HPLC में भंग कर रहे हैं दवा / कार्गो (4 छवि) के absorbance उपाय किया जा सकता है. जहां ज्ञात नैनोकणों के निर्धारित मात्रा 30 स्लाइड - ए Lyzer मिनी डायलिसिस इकाइयों में dialyzed हैं दवा रिलीज गतिज अध्ययन किया जा सकता है. निश्चित समय अंतराल पर, डायलिसिस यूनिट में सामग्री एकत्र की है और कार्बनिक विलायक के बराबर मात्रा नैनोकणों भंग करने के लिए जोड़ा जाता है. HPLC इन नमूनों पर किया जाता है सामग्री / दवा कार्गो यों.
चित्रा 1. EDC / एनएचएस रसायन शास्त्र
चित्रा 2. Polymeric नैनोकणों की तैयारी के लिए Nanoprecipitation विधि (acetonitrile या डीसीएम) विलायक खूंटी PLGA diblock और दवा या कार्गो कण में लोड किया जा युक्त कार्बनिक समाधान जोड़ा जाता है, एच 2 ओ सरगर्मी के 3-5 एमएल के लिए dropwise
चित्रा 3. पारेषण nanopartices इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी. खूंटी PLGA के एक मंदिर छवि wortamin युक्त नैनोकणों. Phosphotungstic एसिड एक विपरीत एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया था.
चित्रा 4. नैनोकणों से nanoparticle से दवा की नियंत्रित रिलीज. Paclitaxel पीबीएस में डायलिसिस के बाद रिलीज. विख्यात समय कणों डायलिसिस कैसेट से हटा दिया गया और acetonitrile में solublized. समाधान HPLC द्वारा मापा गया था. नैनोकणों के दो अलग बहुत की तुलना में थे.
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Discussion
nanoprecipitation सह पॉलिमर - diblock पद्धति का उपयोग करके एक सरल, तेजी से विधि polymeric नैनोकणों इंजीनियर का प्रतिनिधित्व करता है. परिणामस्वरूप नैनोकणों एक hydrophobic कोर, जो खराब घुलनशील यौगिकों के वितरण के लिए उपयोग किया जा सकता का बना रहे हैं. सतह हाइड्रोफिलिक परत उत्कृष्ट जलीय विलेयता सक्षम बनाता है, जबकि संभावित लक्ष्यीकरण ligand आगे संयुग्मन के लिए एक आधा भाग प्रदान.
Liposomes सहित कई nanoparticle प्लेटफार्मों, polymeric नैनोकणों, dendrimers, धातु कण, और क्वांटम 14 डॉट्स हैं. इन प्लेटफार्मों के अलावा, polymeric nanoparticle मंच के लिए तैयार आसान और अनुप्रयोगों के मामले में सबसे बहुमुखी में से एक है. यह न्यूनतम उपकरणों सेटअप की आवश्यकता है और तकनीक कई घंटों में सीखा जा सकता है. यह भी आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला है और इसकी biocompatibility दोनों इन विट्रो में और vivo में अनुप्रयोगों में सक्षम बनाता है. इसके लिए एक मालवाहक ले जाने की क्षमता इमेजिंग और चिकित्सीय क्षमताओं की अनुमति देता है.
EDC / एनएचएस रसायन शास्त्र यहाँ प्रस्तुत है diblock copolymer उत्पन्न. हालांकि, ब्लॉक copolymers विभिन्न उत्प्रेरक का उपयोग करके संश्लेषित किया जा सकता है. एक और सामान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले उत्प्रेरक कलई युक्त octoate है. खूंटी के टर्मिनल हाइड्रॉक्सिल समूहों के समूहों की शुरुआत करने के लिए ब्लॉक copolymers synthesize के रूप में इस्तेमाल किया जाता है. Lactide और glycolide की रिंग polymerization dihydroxy खूंटी या monomethoxy खूंटी द्वारा शुरू ए.बी.ए. या अटल बिहारी प्रकार ब्लॉक 15 क्रमशः copolymers के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इस विधि की तैयारी के डिजाइन में और अधिक लचीलापन देता है, लेकिन रसायन विज्ञान / EDC एनएचएस उपयोग करने के लिए आसान है और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध PLGA बहुलक का उपयोग करके समय बचा सकते हैं.
Nanoprecipitation के अलावा, अन्य तरीकों उत्पन्न करने के लिए diblock बहुलक नैनोकणों इस्तेमाल किया जा सकता है. एक आम विकल्प एक "पानी में तेल पायस 16 विधि है. पायस विधि फिर से एक कार्बनिक diblock copolymer और एक जलकृत चरण युक्त चरण के साथ शुरू होता है. हालांकि, दो समाधान मिश्रण पर, नैनोकणों vortexing और sonicating के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं. यह तरीका बहुत समान है, लेकिन nanoprecipitaion विधि मिश्रण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कदम में और अधिक नियंत्रण की अनुमति देता है sonication के प्रयोग से बचा जाता है.
इस मंच के लिए कई संभावित आवेदन कर रहे हैं. सबसे पहले, यह दवा वितरण के अध्ययन में हाइड्रोफोबिक / खराब घुलनशील दवाओं की डिलीवरी के लिए उपयोग किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, taxanes खराब घुलनशील हैं और vivo अध्ययन में के लिए एक विलायक की आवश्यकता होती है. Polymeric नैनोकणों taxane दवाओं encapsulate और सॉल्वैंट्स के लिए की जरूरत को रद्द कर सकते हैं. नैनोकणों भी कोशिका जीव विज्ञान अभिकर्मकों कि खराब wortmannin जैसे घुलनशील हैं वितरित कर सकते हैं. पॉलिमर नैनोकणों भी फ्लोरोसेंट रंजक के साथ लोड किया जा सकता है और intracellular तस्करी अध्ययन के लिए उपयोग किया. इन बहुलक नैनोकणों सतह खूंटी के माध्यम से ligands लक्ष्यीकरण संयुग्मित किया जा सकता है. फ्लोरोसेंट लेबलिंग के साथ संयुक्त, इन लक्षित नैनोकणों कोशिकाओं पर या में विशिष्ट epitopes लेबल इस्तेमाल किया जा सकता है. चूंकि प्रत्येक nanoparticle फ्लोरोसेंट अणु की एक बड़ी संख्या में encapsulate कर सकते हैं, नैनोकणों जैसे जैविक अध्ययन की संवेदनशीलता में सुधार कर सकते हैं. प्रतिदीप्त नैनोकणों लेबल भी vivo इमेजिंग में उपयोग कर सकते हैं रक्त वाहिकाओं और atherosclerotic सजीले टुकड़े के दृश्य के रूप में हो .
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के कैंसर नैनो उत्कृष्टता पायलट अनुदान, विश्वविद्यालय के कैंसर रिसर्च फंड और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान K-12 कैरियर विकास पुरस्कार के लिए केरोलिना केंद्र के खिलाफ Golfers द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDC | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | Conjugation Reagent |
| NHS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | Conjugation Reagent |
| amine-PEG-carboxylate | Laysan Bio Inc. | Nh2-PEG-CM-5000 | Polymer (Can use any PEG MW, 5000 is listed here) |
| PLGA-carbxylate |  Lactel |
B6013-2 | Polymer |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 34856 | Solvent |
| Acetonitrile >99% purity | Sigma-Aldrich | 34851 | Solvent |
| Methanol >99% purity | Sigma-Aldrich | 34860 | Wash |
References
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