Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass

Resumen

Este protocolo demostrará la extracción y el análisis de ácidos grasos bioactivos libres y esterificados de las células. Los ácidos grasos se cuantifican con precisión mediante dilución de isótopos estables, cromatografía líquida quiral, captura de electrones, ionización química atmosférica, espectrometría de masas de monitoreo de reacciones múltiples (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Resumen

El metabolismo de los ácidos grasos, como el ácido araquidónico (AA) y el ácido linoleico (LA), da lugar a la formación de lípidos bioactivos oxidados, incluyendo numerosos estereoisómeros^1,2. Estos metabolitos pueden formarse a partir de ácidos grasos libres o esterificados. Muchos de estos metabolitos oxidados tienen actividad biológica y han sido implicados en diversas enfermedades, incluyendo enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas, asma y cáncer^3-7. Los lípidos bioactivos oxidados pueden formarse enzimáticamente o por especies reactivas de oxígeno (ROS). Las enzimas que metabolizan los ácidos grasos incluyen la ciclooxigenasa (COX), la lipoxigenasa (LO) y los citocromos P450 (CYPs)^1,8. El metabolismo enzimático da lugar a la formación enantioselectiva, mientras que la oxidación de las ROS da lugar a la formación racémica de productos.

Si bien este protocolo se centra principalmente en el análisis de AA- y algunos metabolitos bioactivos derivados de LA; podría aplicarse fácilmente a metabolitos de otros ácidos grasos. Los lípidos bioactivos se extraen del lisado celular o de los medios mediante extracción líquido-líquido (l-l). Al comienzo del proceso de extracción l-l, se agregan patrones internos de isótopos estables para tener en cuenta los errores durante la preparación de la muestra. La dilución de isótopos estables (SID) también explica las diferencias, como la supresión de iones, que los metabolitos pueden experimentar durante el análisis de espectrometría de masas (MS)⁹. Después de la extracción, se emplea la derivatización con un reactivo de captura de electrones (EC), bromuro de pentafluorilbencil (PFB) para aumentar la sensibilidad de detección^10,11. La monitorización de reacciones múltiples (MRM) se utiliza para aumentar la selectividad del análisis MS. Antes del análisis de MS, los lípidos se separan mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de fase normal quiral. Las condiciones de HPLC están optimizadas para separar los enantiómeros y los diversos estereoisómeros de los lípidos monitorizados¹². Este método específico de LC-MS monitoriza las prostaglandinas (PGs), los isoprostanos (isoPs), los ácidos hidroxieicosatetraenoico (HETEs), los ácidos hidroxioctadecadienoicos (HODEs), los ácidos oxoeicosatetraenoico (oxoETEs) y los ácidos oxooctadecadienoicos (oxoODEs); sin embargo, los parámetros de HPLC y MS pueden optimizarse para incluir cualquier metabolito de ácidos grasos¹³.

La mayoría de los métodos bioanalíticos disponibles actualmente no tienen en cuenta la cuantificación separada de los enantiómeros. Esto es extremadamente importante cuando se trata de deducir si los metabolitos se formaron enzimáticamente o por ROS. Además, las proporciones de los enantiómeros pueden proporcionar evidencia de una vía enzimática específica de formación. El uso de SID permite una cuantificación precisa de los metabolitos y tiene en cuenta cualquier pérdida de muestra durante la preparación, así como las diferencias experimentadas durante la ionización. El uso del reactivo de captura de electrones PFB aumenta la sensibilidad de detección en dos órdenes de magnitud en comparación con los métodos APCI convencionales. En general, este método, SID-LC-EC-ionización química a presión atmosférica APCI-MRM/MS, es uno de los métodos más sensibles, selectivos y precisos de cuantificación de lípidos bioactivos.

Protocolo

1. Mezclas estándar e internas

1. Antes de la extracción de lípidos, se debe preparar una mezcla estándar (SM) y una mezcla estándar interna (ISM). En el caso del SM, alícuota el volumen equivalente de 1 μg de cada patrón (25 en total) enumerado en la tabla de reactivos que figura a continuación, utilizando una jeringa calibrada, en un matraz aforado de 10 mL. Secar los patrones bajo nitrógeno y reconstituirlos en 10 mL de acetonitrilo (ACN). La concentración final de la mezcla estándar será de 100 pg/μL. Divida en alícuotas de 1 mL y almacene a -80 °C hasta que se necesite.
2. A partir de esta mezcla estándar, se pueden hacer 6 diluciones estándar para un total de 7 patrones de calibración (1 pg/ μL, 2 pg/ μL, 5 pg/ μL, 10 pg/ μL, 20 pg/ μL, 50 pg/ μL y 100 pg/ μL). Estos patrones deben ejecutarse con cada lote de muestras preparadas para desarrollar la curva de calibración utilizada en el análisis cuantitativo.
3. En el caso del ISM, alícuota el volumen equivalente de 1 μg de cada IS (14 en total) indicado en la tabla de reactivos que figura a continuación en un matraz aforado de 10 ml, utilizando una jeringa calibrada, y séquelo con nitrógeno. Reconstituya el ISM en 10 mL de ACN y divídalo en alícuotas de 1 mL. La concentración final del ISM debe ser de 100 pg/μL. Hay suficiente ISM para procesar 1000 muestras.
4. Almacene el SM y el ISM a -80 °C.

2. Recolección de medios y lisado celular

1. Por cada placa de 10 cm de células adherentes (~ 1 X 10⁷), recoja 3 mL de medio en un tubo de centrífuga de vidrio de 10 mL. A continuación, lave las células 2 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Agregue 1 mL de PBS a la placa y raspe las celdas de la placa y pipetee en un segundo tubo de centrífuga de vidrio de 10 mL. En este punto, es posible que se almacenen células y medios si el procedimiento no se continúa en este momento. Almacene las muestras a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo o a -20 °C durante menos de una semana.

3. Extracción de lípidos de los medios

1. Los lípidos bioactivos libres se encuentran en los medios celulares y estos se extraen fácilmente con un procedimiento de extracción de un solo paso. A los medios recogidos (2.1), añadir 10 μL de ISM. En este momento, 8 tubos de centrífuga de vidrio de 10 mL adicionales deben estar etiquetados como #0-7 para los estándares de calibración. Añada 3 mL de PBS a cada uno de estos tubos y luego agregue 10 μL del SM apropiado a los tubos 1-7 (1-7 desde 1.1).
2. Deje que el ISM se equilibre en cada patrón de calibración y muestreo durante 10 minutos y luego agregue 5 mL de éter dietílico. A continuación, las muestras y los patrones de calibración se colocan en el agitador a baja velocidad durante 30 minutos a temperatura ambiente.
3. Después de agitar, todos los patrones de calibración y las muestras se centrifugan a 1935 x g durante 10 minutos. A continuación, con una pipeta Pasteur, transfiera la fase superior (orgánica) a un nuevo tubo de centrífuga de vidrio de 10 ml y séquela con nitrógeno.

4. Extracción de lípidos del lisado celular

1. Gire las muestras de células en los tubos de centrífuga de vidrio a 1935 X g durante 5 minutos. Desechar el sobrenadante; agregue 2 mL de PBS a cada tubo y vórtice brevemente. Extraer 25 μL de muestra para la cuantificación de proteínas. La proteína total se utilizará para la normalización del lisado celular.
2. A continuación, transfiera la mitad de la mezcla de lisado/PBS a un tubo de centrífuga de vidrio de 10 ml separado. Agregue 2 ml adicionales de PBS junto con 10 μl de ISM a cada muestra. Siga el proceso de extracción l-l descrito para los medios en 3.2 y 3.3. Esta alícuota se utilizará para medir los lípidos libres en las células y evitar la degradación alcalina de los lípidos, como las prostaglandinas. Esta alícuota no se someterá a los pasos 4.3 y 4.4 que se describen a continuación.
3. El primer paso del proceso de extracción de lípidos esterificados l-l requiere la adición de 5 mL de CHCl₃/MeOH (2:1) a cada una de las muestras. Las muestras se colocan en un agitador a baja velocidad durante 30 minutos. Después de agitar, las muestras se centrifugan a 1935 x g durante 10 minutos. A continuación, con una pipeta Pasteur, transfiera la capa inferior (orgánica) de la extracción l-l a un nuevo tubo de centrífuga de vidrio de 10 mL y seque la muestra con nitrógeno.
4. Los lípidos esterificados deben ser saponificados antes de la cuantificación. Una vez que las muestras estén secas, agregue 0,5 mL de 0,4N KOH en 80% de MeOH a cada tubo. A continuación, las muestras se incuban a 60 °C durante 1 h. Después de la incubación, agregue 2 mL de PBS. Ajuste el pH a 6 con ácido HCl concentrado (~30 μL). Añada 10 μL de ISM a cada muestra. El resto del procedimiento es el mismo que la extracción de lípidos del medio y se puede seguir en 3.2 y 3.3.
5. Si estas extracciones se realizan simultáneamente con las muestras de medios, se pueden utilizar los mismos patrones de calibración para desarrollar una curva de calibración; sin embargo, si estas muestras se ejecutan en otro momento, los patrones de calibración también deben procesarse como se describe en 3.1-3.3.

5. Derivatización del pentafluorilbencilbromuro (PFB)

1. A las muestras secas y a los patrones de calibración, se añadan 100 μL de diclorometano anhidro (CH₂Cl₂) seguido de 100 μL de N,N-diisopropiletilamina al 20% (v/v) en CH₂Cl₂ anhidro y, finalmente, 100 μL de PFB al 20% (v/v) en CH₂Cl₂ anhidro.
2. Después de la adición de reactivos de derivatización, las muestras se agitan en vórtice, se incuban a 60 °C durante 1 h y se secan bajo nitrógeno. Las muestras y los patrones de calibración pueden almacenarse a -80 °C si no se analizan inmediatamente o a -20 °C durante un máximo de una semana.

6. Dilución de isótopos estables Cromatografía líquida quiral Captura de electrones Ionización química Análisis de espectrometría de masas de ionización química (SID-LC-ECAPCI-MS)

1. Las muestras secas y los patrones de calibración se reconstituyen en 100 μL de hexano/etanol (97:3). A continuación, toda la muestra puede transferirse al vial de HPLC con inserto. Coloque las muestras en el muestreador automático refrigerado (4 °C) y cree una lista de muestras para su análisis.
2. A continuación, configure los métodos HPLC y MS utilizando los parámetros descritos en la Tabla 1 y la Tabla 2 a continuación. La Tabla 3 contiene información específica de los compuestos, incluida la transición MRM y la energía de colisión (CE) para cada lípido, así como el tiempo de retención estimado del análisis Waters 2695/Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra. La CE se determina ajustando cada lípido individual durante el desarrollo del método.
3. Para la separación de fases normal se utiliza una columna AD-H de Chiralpak (4,6 X 250 mm, 5 μ) calentada a 30 °C. La fase móvil inicial es 98% hexano y 2% metanol/isopropanol (1:1). Después de la separación por HPLC, se añade metanol después de la columna (0,75 mL/min) para evitar la deposición en la aguja Corona que provocaría una disminución de la sensibilidad. La EM se configura en modo de iones negativos utilizando la fuente APCI. Si es necesario cambiar la fuente de ESI a APCI, asegúrese de insertar una aguja Corona.
4. La primera muestra que se debe ejecutar es siempre un blanco de hexano. Esto equilibrará la columna y también revelará si hay alguna contaminación en la columna que pueda interferir con el estándar de calibración y el análisis de la muestra.
5. Las siguientes muestras ejecutadas deben ser las muestras estándar de calibración en orden de 0 a 7 (concentración de SM creciente). Estos patrones se utilizarán para crear una curva de calibración que contenga la relación entre el área estándar/área IS en el eje Y y la concentración o masa estándar en el eje X. A partir de la ecuación y = mx + b derivada de este gráfico, la relación entre el área de la muestra y el área IS (y) se puede utilizar para determinar la cantidad o concentración de la muestra (desconocida) (x).
6. La cantidad de lípidos bioactivos que se encuentran en el medio se puede normalizar al volumen total del medio y la cantidad de lípidos que se encuentran en el lisado celular se puede normalizar al número total de células/placa o a la cantidad total de proteína/placa. Se deben tomar medidas durante el punto 4.1 del protocolo para garantizar que se cuenten las células o que se cuantifique la proteína.

7. Resultados representativos:

Los cromatogramas de la Figura 1 son representativos de un perfil lipidómico dirigido. El primer panel (Figura 1A) muestra el 13- y el 9-HODE junto con el correspondiente 13- y 9-oxoODE, derivados del ácido linoleico. Además, en el segundo panel también se muestra el 15-oxoETE, el metabolito oxidado del 15-HETE. Los dos paneles inferiores muestran el 20-HETE y el 20-HETE-IS, [²H₆]-20-HETE. La Figura 1B muestra la separación y las transiciones únicas determinadas para los estereoisómeros HETE que resultan de la oxidación enzimática de AA o por ROS. La figura 1C es una representación de PG, isoP y LTB₄. Algunos de los estándares no tienen un SI deuterado disponible comercialmente; por lo tanto, se utiliza un IS que es similar en tiempo de retención para la cuantificación. Por ejemplo, [²H₈]-12(S)-HETE se utiliza para cuantificar las especies de 11-HETE y 8-HETE además de 12(R)-HETE y 12(S)-HETE.

A partir de los cromatogramas representativos, es evidente que hay un pequeño cambio en la retención del IS deuterado en comparación con el estándar no etiquetado. Este cambio a un tiempo de retención posterior es el resultado de la interacción del deuterio con la columna de fase normal. El deuterio es más polar que el hidrógeno; Por lo tanto, hay una interacción más fuerte con la fase normal de la columna. Si esta separación tuviera lugar utilizando una columna de fase invertida, el cambio sería a un tiempo de retención más temprano, ya que una fracción más polar tendría una interacción más débil con la fase invertida.

Figura 1. Esta figura es un ejemplo representativo de un análisis lipidómico dirigido. La Figura 1A muestra los cromatogramas iónicos totales (TIC) para varios metabolitos oxidados de LA y AA, incluidos 13-oxoODE y 9-oxoODE en el primer panel, 15-oxoETE en el segundo panel, 13-HODE y 9-HODE (paneles 3 y 5) y 20-HETE (panel 7). Los HODE y 20-HETE tienen un IS deuterado correspondiente en el panel de abajo (4, 6 y 8). Los TICs de la Figura 2B muestran la separación y las transiciones únicas de los estereoisómeros HETE derivados de AA. La figura 2C es una representación de PG, isoP y LT. La energía de colisión (CE), las transiciones MRM y el tiempo de retención (RT, min) se optimizaron utilizando un Waters 2695 LC acoplado a un Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra y se enumeran en la Tabla 3 para cada compuesto.

Tiempo (min)	% A	% B
0	98	número arábigo
3	98	número arábigo
11	Artículo 96.4	3.6
15	92	8
27	92	8
30	50	50
38	50	50
39	98	número arábigo
45	98	número arábigo

Tabla 1. Condiciones de gradiente de HPLC para la separación lipidómica en fase normal quiral. El disolvente A es 100% hexanos y el disolvente B es metanol/isopropanol (1:1).

Parámetro de espectrometría de masas	ajuste
fuente	APCI
modo	Ion negativo
Longitud del método	40 minutos
Ancho de escaneo MRM	0,002 m/z
Tiempo de escaneo MRM	0.15 segundos
Anchura del pico MRM	0.70 FWHM
Lente de tubo	164 V
Fuente: CID	10 eV
Q2 Gas de colisión	1.5 unidades
Temperatura del vaporizador	450°C
Temperatura capilar	250°C
Corriente de descarga	0 μA
Presión de gas de la vaina	25 unidades
Presión de barrido iónico	3 unidades
Presión de gas auxiliar	5 unidades

Tabla 2. Arriba se enumeran los parámetros optimizados de espectrometría de masas para la medición de lípidos bioactivos. Estos parámetros se toman de un Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.

compuesto	transición	CE (eV)	RT (min)
13-oxoODE	293,03 → 113,10	21	9.9
9-oxoODE	293,03 → 113,10	21	Artículo 17.9
15-oxoETE	317,05 → 113,18	18	8.1
13(R)-HODE	295,03 → 195,12	18	12.5
13(S)-HODE	295,03 → 195,12	18	Artículo 14.8
[2H4]-13(S)-HODE	299,03 → 198,12	18	Artículo 14.9
9(R)-HODE	295,03 → 171,10	18	Artículo 13.7
9(S)-HODE	295,03 → 171,10	18	Artículo 21.2
[2H4]-9(S)-HODE	299,03 → 172,12	18	Artículo 21.2
20-HETE	319,03 → 289,10	18	Artículo 12.4
[2H6]-20-HETE	325,03 → 295,10	18	Artículo 12.4
5(R)-HETE	319,04 → 115,04	16	Artículo 15.7
5(S)-HETE	319,04 → 115,04	16	Artículo 16.2
[2H8]-5(S)-HETE	327,04 → 116,04	16	Artículo 16.4
12(R)-HETE	319,04 → 179,11	14	Artículo 11.7
12(S)-HETE	319,04 → 179,11	14	Artículo 12.3
[2H8]-12(S)-HETE	327,13 → 184,11	14	12.5
15(R)-HETE	319,04 → 219,12	13	Artículo 12.4
15(S)-HETE	319,04 → 219,12	13	Artículo 15.9
[2H8]-15(S)-HETE	327,03 → 226,12	13	Artículo 16.1
11(R)-HETE	319,04 → 167,11	16	Artículo 11.1
11(S)-HETE	319,04 → 167,11	16	12.5
8(R)-HETE	319,04 → 155,09	16	Artículo 11.7
8(S)-HETE	319,04 → 155,09	16	Artículo 12.6
LTB4	335,03 → 195,10	18	32.0
[2H4]-LTB4	339,03 → 197,10	18	32.0
PGE2	351,03 → 271,15	18	Artículo 31.2
[2H4]-PGE2	355,03 → 275,15	18	Artículo 31.2
PGD2	351,03 → 271,15	25	32.5
[2H4]-PGD2	355,03 → 275,15	25	32.5
8-iso-PGE2	351,03 → 271,15	18	Artículo 37.4
11β-PGF2	353,03 → 193,11	25	Artículo 27.6
[2H4]-11β-PGF2	357,03 → 197,11	25	Artículo 27.6
PGF2α	353,03 → 193,11	25	Artículo 33.1
[2H4]-PGF2α	357,03 → 197,11	25	Artículo 33.1
8-iso-PGF2α	353,03 → 193,11	25	Artículo 34.4
[2H4]-8-iso-PGF 2α	357,03 → 197,11	25	Artículo 34.4

Tabla 3. Esta tabla enumera los compuestos detectados en los cromatogramas iónicos totales de la Figura 1A-C. La segunda columna proporciona la transición utilizada para MRM/MS, la tercera columna enumera la energía de colisión (CE, eV) y la última columna enumera el tiempo de retención (RT, min). Los parámetros se optimizaron utilizando un módulo de separación Waters 2695 acoplado a un Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.

Discusión

Los estándares y estándares internos utilizados en este protocolo proporcionan una representación de un método lipidómico dirigido. Se utilizó un módulo de separación Waters 2695 y Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra para el análisis LC-MS y la configuración óptima de los parámetros se puede encontrar en las Tablas 1 y 2. Además, este protocolo de extracción fue diseñado para células adherentes, pero puede modificarse para otros tipos de células, así como para otras matrices biológicas, como...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico-6,8,9,11,12,14,15-d7	ácido Cayman Chemical	334250	[2H7]-5-ox–TE Estándar interno
5S-hidroxi-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 ácido	Cayman Chemical	334230	[2H8]-5(S)-HETE Estándar interno
12S-hidroxi-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8	ácido Cayman Chemical	334570	[2H8]-12(S)-HETE Estándar interno
15S-hidroxi-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8	ácido Cayman Chemical	334720	[2H8]-15(S)-HETE Estándar interno
20-hidroxi-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico-16,16,17,17,18,18-d6 ácido	Cayman Chemical	390030	[2H6]-20-HETE Estándar interno
9S-hidroxi-10E,12Z-octadecadienoico-9,10,12,13-d4 ácido	Cayman Chemical	338410	[2H4]-9(S)-HODE Estándar interno
13S-hidroxi-9Z,11E-octadecadienoico-9,10,12,13-d4 ácido	Cayman Chemical	338610	[2H4]-13(S)-HODE Estándar interno
9α,11α,15S-trihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,19,20,20,20-d4	ácido Cayman Chemical	316010	[2H4]-PGF2α Estándar interno
9α,11α,15S-trihidroxi-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 ácido	Cayman Chemical	316350	[2H4]-8-iso-PGF2a Estándar interno
9α,11β.,15S-trihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 ácido	Cayman Chemical	10008989	[2H4]-11β-PGF2 Estándar interno
9&alfa;,15S-dihidroxi-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4	ácido Cayman Chemical	312010	[2H4]-PGD2 Estándar interno
9-oxo-11α,15S-dihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,19,20,20,20-d4 ácido	Cayman Chemical	314010	[2H4]-PGE< sub>2 Estándar interno
5S,12R-dihidroxi-6Z,8E,10E,14Z-ácido eicosatetraenoico-6,7,14,15-d4	Cayman Chemical	320110	[2H4]-LTB4 Estándar interno
9α,11,15S-trihidroxi-thromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 ácido	Cayman Chemical	319030	[2H4]-TxB2 Estándar interno
5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-ácido eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34250	5-ox–TE
Estándar 12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-ácido eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34580	12-ox–TE Standard
15-oxo-5Z, Ácido 8Z,11Z,13E-eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34730	15-ox–TE Standard
5R-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico	acid Cayman Chemical	34225	5(R)-HETE Standard
5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico	acid Cayman Chemical	34230	5(S)-HETE Standard
8R-hydroxy-5Z,9E,11Z, Ácido 14Z-eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34350	8(R)-HETE Estándar
8S-hidroxi-5Z,9E,11Z,14Z-ácido eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34360	8(S)-HETE
Estándar 11R-hidroxi-5Z,8Z,12E,14Z-ácido eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34505	11(R)-HETE Standard
11S-hidroxi-5Z,8Z,12E, Ácido 14Z-eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34510	11(S)-HETE Standard
12R-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoico	acid Cayman Chemical	34560	12(R)-HETE Standard
12S-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoico	acid Cayman Chemical	34570	12(S)-HETE Standard
15R-hydroxy-5Z,8Z,11Z, Ácido 13E-eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34710	15(R)-HETE Estándar
15S-hidroxi-5Z,8Z,11Z,13E-ácido eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34720	15(S)-HETE
Ácido 20-hidroxi-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico	Cayman Chemical	90030	20-HETE Estándar
9R-hidroxi-10E,12Z-octadecadienoico	Cayman Chemical	38405	9(R)-HODE Estándar
9S-hidroxi-10E,12Z-octadecadienoico	ácido Cayman Chemical	38410	9(S)-HODE Estándar
13R-hidroxi-9Z,11E-octadecadienoico	ácido Cayman Chemical	38605	13(R)-HODE Estándar
13S-hidroxi-9Z,11E-octadecadienoico	ácido Cayman Chemical	38610	13(S)-HODE Estándar
9α,11α,15S-trihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic	acid Cayman Chemical	16010	PGF2α Estándar
9α,11α,15S-trihidroxi-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic	ácido Cayman Chemical	16350	8-iso-PGF2α Estándar
9&alfa;,11β,15S-trihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oico	ácido Cayman Chemical	16520	11β-PGF2 Estándar
9α,15S-dihidroxi-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic	ácido Cayman Chemical	12010	PGD2 Estándar
9-oxo-11α,15S-dihidroxi-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic	ácido Cayman Chemical	14350	8-iso-PGE2 Estándar
9-oxo-11α,15S-dihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic	ácido Cayman Chemical	14010	PGE2 Estándar
5S,12R-dihidroxi-6Z,8E,10E,14Z-ácido eicosatetraenoico	Cayman Chemical	20110	LTB4 Estándar
9&alfa;,11,15S-trihidroxitromba-5Z,13E-dien-1-oic	ácido Cayman Chemical	19030	TxB2 Solución
salina tamponada con fosfato	GIBCO, por Life Technologies	14190
Éter dietílico	Sigma-Aldrich	346136
diclorometano	Acros Organics	61030-1000	anhidro
N,N-diisopropiletilamina	Sigma-Aldrich	387649
Bromuro de pentafluorilbencil	Sigma-Aldrich	101052
Ácido clorhídrico	Sigma-Aldrich	320331
Hidróxido de potasio	Fluka	00650
Acetonitrilo	Fisher Scientific	A996-4
Metanol	Fisher Scientific	A454-4
Cloroformo	Fisher Scientific	366927
Hexano	Fisher Scientific	H303-4
Isopropanol	Fisher Scientific	A464-4
Etanol	Decon Laboratories	2716
	Agua Fisher Scientific	W7-4
Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-200
Tubos de centrífuga de vidrio de 10 mL	Kimble Chase	73785-10	Tapón de rosca
Tapones de rosca fenólicos	Kimble Chase	73802-13415
Columna Chiralcel ADH	Chiral Technologies	19325
Viales de HPLC	Waters	60000751CV
Insertos de HPLC	Waters WAT094171