Artículo de método

Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass

DOI:

10.3791/3399

⸱

17 de noviembre de 2011

 ,  , 
1Centers for Cancer Pharmacology and Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania , 2Department of Pharmacology, University of Pennsylvania

En este artículo

Resumen

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Este protocolo demostrará la extracción y el análisis de ácidos grasos bioactivos libres y esterificados de las células. Los ácidos grasos se cuantifican con precisión mediante dilución de isótopos estables, cromatografía líquida quiral, captura de electrones, ionización química atmosférica, espectrometría de masas de monitoreo de reacciones múltiples (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El metabolismo de los ácidos grasos, como el ácido araquidónico (AA) y el ácido linoleico (LA), da lugar a la formación de lípidos bioactivos oxidados, incluyendo numerosos estereoisómeros1,2. Estos metabolitos pueden formarse a partir de ácidos grasos libres o esterificados. Muchos de estos metabolitos oxidados tienen actividad biológica y han sido implicados en diversas enfermedades, incluyendo enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas, asma y cáncer3-7. Los lípidos bioactivos oxidados pueden formarse enzimáticamente o por especies reactivas de oxígeno (ROS). Las enzimas que metabolizan los ácidos grasos incluyen la ciclooxigenasa (COX), la lipoxigenasa (LO) y los citocromos P450 (CYPs)1,8. El metabolismo enzimático da lugar a la formación enantioselectiva, mientras que la oxidación de las ROS da lugar a la formación racémica de productos.

Si bien este protocolo se centra principalmente en el análisis de AA- y algunos metabolitos bioactivos derivados de LA; podría aplicarse fácilmente a metabolitos de otros ácidos grasos. Los lípidos bioactivos se extraen del lisado celular o de los medios mediante extracción líquido-líquido (l-l). Al comienzo del proceso de extracción l-l, se agregan patrones internos de isótopos estables para tener en cuenta los errores durante la preparación de la muestra. La dilución de isótopos estables (SID) también explica las diferencias, como la supresión de iones, que los metabolitos pueden experimentar durante el análisis de espectrometría de masas (MS)9. Después de la extracción, se emplea la derivatización con un reactivo de captura de electrones (EC), bromuro de pentafluorilbencil (PFB) para aumentar la sensibilidad de detección10,11. La monitorización de reacciones múltiples (MRM) se utiliza para aumentar la selectividad del análisis MS. Antes del análisis de MS, los lípidos se separan mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de fase normal quiral. Las condiciones de HPLC están optimizadas para separar los enantiómeros y los diversos estereoisómeros de los lípidos monitorizados12. Este método específico de LC-MS monitoriza las prostaglandinas (PGs), los isoprostanos (isoPs), los ácidos hidroxieicosatetraenoico (HETEs), los ácidos hidroxioctadecadienoicos (HODEs), los ácidos oxoeicosatetraenoico (oxoETEs) y los ácidos oxooctadecadienoicos (oxoODEs); sin embargo, los parámetros de HPLC y MS pueden optimizarse para incluir cualquier metabolito de ácidos grasos13.

La mayoría de los métodos bioanalíticos disponibles actualmente no tienen en cuenta la cuantificación separada de los enantiómeros. Esto es extremadamente importante cuando se trata de deducir si los metabolitos se formaron enzimáticamente o por ROS. Además, las proporciones de los enantiómeros pueden proporcionar evidencia de una vía enzimática específica de formación. El uso de SID permite una cuantificación precisa de los metabolitos y tiene en cuenta cualquier pérdida de muestra durante la preparación, así como las diferencias experimentadas durante la ionización. El uso del reactivo de captura de electrones PFB aumenta la sensibilidad de detección en dos órdenes de magnitud en comparación con los métodos APCI convencionales. En general, este método, SID-LC-EC-ionización química a presión atmosférica APCI-MRM/MS, es uno de los métodos más sensibles, selectivos y precisos de cuantificación de lípidos bioactivos.

Protocolo

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1. Mezclas estándar e internas

  1. Antes de la extracción de lípidos, se debe preparar una mezcla estándar (SM) y una mezcla estándar interna (ISM). En el caso del SM, alícuota el volumen equivalente de 1 μg de cada patrón (25 en total) enumerado en la tabla de reactivos que figura a continuación, utilizando una jeringa calibrada, en un matraz aforado de 10 mL. Secar los patrones bajo nitrógeno y reconstituirlos en 10 mL de acetonitrilo (ACN). La concentración final de la mezcla estándar será de 100 pg/μL. Divida en alícuotas de 1 mL y almacene a -80 °C hasta que se necesite.
  2. A partir de esta mezcla estándar, se pueden hacer 6 diluciones estándar par....

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Discusión

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Los estándares y estándares internos utilizados en este protocolo proporcionan una representación de un método lipidómico dirigido. Se utilizó un módulo de separación Waters 2695 y Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra para el análisis LC-MS y la configuración óptima de los parámetros se puede encontrar en las Tablas 1 y 2. Además, este protocolo de extracción fue diseñado para células adherentes, pero puede modificarse para otros tipos de células, así como para otras matrices biológicas, como.......

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Divulgaciones

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No se declaran conflictos de intereses.

Agradecimientos

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La mayoría de los métodos bioanalíticos actuales disponibles para la medición de lípidos bioactivos no son tan extensos, ya que no incluyen cromatografía quiral de fase normal o SID. La fase normal quiral LC es crítica para la separación de enantiómeros y para poder distinguir entre el metabolismo mediado por enzimas o ROS. El uso de SID garantiza que los errores humanos o las complicaciones que surjan durante la extracción o el análisis se tengan en cuenta durante la cuantificación. Estos componentes añadidos, junto con ECAPCI-MRM, lo convierten en el método más sensible y selectivo disponible para el análisis de lípidos bioactivos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico-6,8,9,11,12,14,15-d7ácido Cayman Chemical334250[2H7]-5-ox–TE Estándar interno
5S-hidroxi-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 ácidoCayman Chemical334230[2H8]-5(S)-HETE Estándar interno
12S-hidroxi-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8ácido Cayman Chemical334570[2H8]-12(S)-HETE Estándar interno
15S-hidroxi-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8ácido Cayman Chemical334720[2H8]-15(S)-HETE Estándar interno
20-hidroxi-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico-16,16,17,17,18,18-d6 ácidoCayman Chemical390030[2H6]-20-HETE Estándar interno
9S-hidroxi-10E,12Z-octadecadienoico-9,10,12,13-d4 ácidoCayman Chemical338410[2H4]-9(S)-HODE Estándar interno
13S-hidroxi-9Z,11E-octadecadienoico-9,10,12,13-d4 ácidoCayman Chemical338610[2H4]-13(S)-HODE Estándar interno
9α,11α,15S-trihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,19,20,20,20-d4ácido Cayman Chemical316010[2H4]-PGF2α Estándar interno
9α,11α,15S-trihidroxi-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 ácidoCayman Chemical316350[2H4]-8-iso-PGF2a Estándar interno
9α,11β.,15S-trihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 ácidoCayman Chemical10008989[2H4]-11β-PGF2 Estándar interno
9&alfa;,15S-dihidroxi-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4ácido Cayman Chemical312010[2H4]-PGD2 Estándar interno
9-oxo-11α,15S-dihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,19,20,20,20-d4 ácidoCayman Chemical314010[2H4]-PGE< sub>2 Estándar interno
5S,12R-dihidroxi-6Z,8E,10E,14Z-ácido eicosatetraenoico-6,7,14,15-d4Cayman Chemical320110[2H4]-LTB4 Estándar interno
9α,11,15S-trihidroxi-thromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 ácidoCayman Chemical319030[2H4]-TxB2 Estándar interno
5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-ácido eicosatetraenoicoCayman Chemical342505-ox–TE
Estándar 12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-ácido eicosatetraenoicoCayman Chemical3458012-ox–TE Standard
15-oxo-5Z, Ácido 8Z,11Z,13E-eicosatetraenoicoCayman Chemical3473015-ox–TE Standard
5R-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoicoacid Cayman Chemical342255(R)-HETE Standard
5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoicoacid Cayman Chemical342305(S)-HETE Standard
8R-hydroxy-5Z,9E,11Z, Ácido 14Z-eicosatetraenoicoCayman Chemical343508(R)-HETE Estándar
8S-hidroxi-5Z,9E,11Z,14Z-ácido eicosatetraenoicoCayman Chemical343608(S)-HETE
Estándar 11R-hidroxi-5Z,8Z,12E,14Z-ácido eicosatetraenoicoCayman Chemical3450511(R)-HETE Standard
11S-hidroxi-5Z,8Z,12E, Ácido 14Z-eicosatetraenoicoCayman Chemical3451011(S)-HETE Standard
12R-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoicoacid Cayman Chemical3456012(R)-HETE Standard
12S-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoicoacid Cayman Chemical3457012(S)-HETE Standard
15R-hydroxy-5Z,8Z,11Z, Ácido 13E-eicosatetraenoicoCayman Chemical3471015(R)-HETE Estándar
15S-hidroxi-5Z,8Z,11Z,13E-ácido eicosatetraenoicoCayman Chemical3472015(S)-HETE
Ácido 20-hidroxi-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoicoCayman Chemical9003020-HETE Estándar
9R-hidroxi-10E,12Z-octadecadienoicoCayman Chemical384059(R)-HODE Estándar
9S-hidroxi-10E,12Z-octadecadienoicoácido Cayman Chemical384109(S)-HODE Estándar
13R-hidroxi-9Z,11E-octadecadienoicoácido Cayman Chemical3860513(R)-HODE Estándar
13S-hidroxi-9Z,11E-octadecadienoicoácido Cayman Chemical3861013(S)-HODE Estándar
9α,11α,15S-trihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oicacid Cayman Chemical16010PGF2α Estándar
9α,11α,15S-trihidroxi-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oicácido Cayman Chemical163508-iso-PGF2α Estándar
9&alfa;,11β,15S-trihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oicoácido Cayman Chemical1652011β-PGF2 Estándar
9α,15S-dihidroxi-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oicácido Cayman Chemical12010PGD2 Estándar
9-oxo-11α,15S-dihidroxi-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oicácido Cayman Chemical143508-iso-PGE2 Estándar
9-oxo-11α,15S-dihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oicácido Cayman Chemical14010PGE2 Estándar
5S,12R-dihidroxi-6Z,8E,10E,14Z-ácido eicosatetraenoicoCayman Chemical20110LTB4 Estándar
9&alfa;,11,15S-trihidroxitromba-5Z,13E-dien-1-oicácido Cayman Chemical19030TxB2 Solución
salina tamponada con fosfatoGIBCO, por Life Technologies14190
Éter dietílicoSigma-Aldrich346136
diclorometanoAcros Organics61030-1000anhidro
N,N-diisopropiletilaminaSigma-Aldrich387649
Bromuro de pentafluorilbencilSigma-Aldrich101052
Ácido clorhídricoSigma-Aldrich320331
Hidróxido de potasioFluka00650
AcetonitriloFisher ScientificA996-4
MetanolFisher ScientificA454-4
CloroformoFisher Scientific366927
HexanoFisher ScientificH303-4
IsopropanolFisher ScientificA464-4
EtanolDecon Laboratories2716
Agua Fisher ScientificW7-4
Pasteur PipetsFisher Scientific13-678-200
Tubos de centrífuga de vidrio de 10 mLKimble Chase73785-10Tapón de rosca
Tapones de rosca fenólicosKimble Chase73802-13415
Columna Chiralcel ADHChiral Technologies19325
Viales de HPLCWaters60000751CV
Insertos de HPLCWaters WAT094171
ácido estándar

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. Arachidonic acid metabolism. Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).
  2. Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. Stereochemical nature of the products....

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