Los huevos y los recubrimientos extracelular alrededor de los huevos con frecuencia liberación péptidos, proteínas y pequeñas moléculas que se comunican con el esperma para guiarlos hacia el óvulo promoviendo así la fecundación. Utilizando el esperma de rana se describen y comparan dos tipos de ensayos para detectar los espermatozoides quimioatracción - ensayos de esperma y la acumulación de pruebas de esperma de seguimiento.
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Artículo de método
Dos tipos de ensayos para la detección de espermatozoides quimioatracción rana
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Resumen
Resumen
Quimioatracción espermatozoides en los invertebrados puede ser lo suficientemente robusta que se puede colocar una pipeta que contiene el péptido atractivo en una suspensión de esperma y microscópicamente visualizar la acumulación de esperma en todo el pipeta de 1. Quimioatracción espermatozoides en los vertebrados como ranas, roedores y seres humanos es más difícil de detectar y requiere ensayos cuantitativos. Estos ensayos son de dos tipos principales - los ensayos que cuantifican el movimiento del esperma a una fuente de quimiotáctica, llamados ensayos de la acumulación de esperma, y los ensayos que en realidad seguimiento de las trayectorias de natación de los espermatozoides individuales.
Los ensayos de la acumulación de esperma están permitiendo a decenas o cientos relativamente rápido de los ensayos a realizar en un solo día, lo que permite curvas de dosis-respuesta y los cursos de tiempo para llevar a cabo de forma relativamente rápida. Este tipo de ensayos se han utilizado ampliamente para caracterizar muchos sistemas bien establecidos quimioatracción - por ejemplo, la quimiotaxis de neutrófilos al bacpéptidos terial y la quimiotaxis de espermatozoides al líquido folicular. Los ensayos de los espermatozoides de seguimiento puede ser más mano de obra, pero ofrecen datos adicionales sobre cómo chemoattractancts alteran realmente el camino que los espermatozoides nadar tomar. Este tipo de ensayo es necesaria para demostrar la orientación del movimiento de los espermatozoides con respecto al eje de degradado chemoattrractant y visualizar resulta característica o cambios en la orientación que llevan los espermatozoides más cerca del óvulo.
A continuación se describen los métodos utilizados para cada uno de estos dos tipos de ensayos. El ensayo de la acumulación de semen utilizado se llama "doble cámara" ensayo. Espermatozoides de anfibios se encuentran en una inserción de placa de cultivo de tejidos con un piso de filtro de policarbonato con poros de 12 micras de diámetro. Insertos con los espermatozoides se colocan en los pozos de la placa de cultivo de tejido que contiene tampón y un chemoatttractant cuidadosamente pipeta en el fondo del pozo donde el piso y la pared (ver fig. 1). Después de la incubación, el inserto superior que contiene el depósito de los espermatozoides es cuidadosamente removed, y los espermatozoides en la cavidad inferior que han pasado a través de la membrana se eliminan, se sedimentaron y contadas por hemocitómetro o citómetro de flujo.
El ensayo de seguimiento de esperma utiliza una cámara Zigmond desarrollado originalmente para la observación de la quimiotaxis de neutrófilos y modificado para la observación de los espermatozoides por Giojalas y compañeros de trabajo 2,3. La cámara se compone de una lámina de vidrio grueso en el que dos canales verticales que se han mecanizado. Estos están separados por una plataforma de observación de 1 mm de ancho. Después de la aplicación de una cubierta de vidrio, los espermatozoides se cargan en un canal, el agente quimiotáctico en el otro y el movimiento de los espermatozoides individuales visualizado por microscopía de vídeo. Las imágenes de vídeo se analiza el uso de software para identificar dos dimensiones los movimientos celulares en el plano xy como una función del tiempo (XYT conjuntos de datos) que forman la trayectoria de cada uno de los espermatozoides.
Protocolo
1. Materiales y los buffers usados
- Buffer Ringer ovocito (1,5 x OR2) contiene 124 mM NaCl, 3,75 mM KCl, 1,5 mM CaCl 2, 1,5 mM de MgCl 2, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 10 mM Hepes, pH 7,8. Buffer de fertilización (F-1) contiene 41,25 mM NaCl, 1,25 mM KCl, 0,25 mM CaCl 2, 0,06 mM de MgCl2, 0,5 mM Na 2 HPO 4, 2,5 mM Hepes, pH 7,8.
- Xenopus laevis agua huevo se prepara según Sugiyama et al. 4. Se describen brevemente, recién generado huevos de rana en gelatina se arremolinaban en un pequeño volumen de F-1 buffer de 30 minutos y el medio ....
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Discusión
Quimiotaxis de células en movimiento, ya sea el movimiento ameboide o nadar flagelos potencia se encuentra en muchos contextos biológicos y el estudio de este fenómeno requiere la disponibilidad de ensayos de práctica y confiable. Algunos ejemplos de este fenómeno, como la atracción de los espermatozoides de un huevo de erizo de mar o la recolección de las células de moho del lodo para formar un cuerpo fructífero, tienen un impacto visual inmediato. La cuantificación de este fenómeno ha llevado a cabo en una variedad de.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Damos las gracias al Laboratorio WM Keck Bioimagen para el uso de su estación de trabajo de video microscopía. Este estudio fue financiado por la NSF IBN-0615435 concesión.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre de la pieza | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Placas de 24 pocillos | Becton-Dickenson | 35/1147 | |
| 12 inserciones mm de diámetro exterior con una membrana de poro de 12 micras | Millipore | PIXP01250 | Antes utilizábamos Costar, Corning placa Transwell # 3403-ahora suspendido |
| Zigmond cámara | Neurosonda | Z02 | |
| El aceite de silicona | General Electric | SF1154 | Equivalente a Dow Corning de fluidos 550 |
| Image J software | Wayne Rasband, Oficina de Servicios de Investigación, Instituto Nacional de Salud Mental | Descarga gratuita en http://rsbweb.nih.gov/ij | De programa de Java que se ejecuta en Windows, LinUX y Mac |
| MtrackJ software | Erik Meijering / Imagescience / Grupo de Imágenes Biomédicas , Erasmus MC - University Medical Center Rotterdam | Descarga gratuita en http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | De programa de Java que se ejecuta en Windows, Linux y Mac |
| Virtual Dub software | Licencia Pública General de GNU de software | Descarga gratis a través http://www.virtualdub.org/index.html | Instrucciones de configuración en la página web de J de la imagen en plugins, sólo para Windows |
| cellSens software | Olimpo | Véase el sitio web: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp? producto = 1070 | Los controles y toma imágenes de una variedad de cámaras. También tiene capacidad de procesamiento de imágenes |
Referencias
- Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L., Vacquier, V. D. Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer. J. Cell Biol. 101, 2324-2329 (1985).
- Olivera, R. G., Tomasi, L., Rovasio, R. A., Giojalas, L. C.
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Reimpresiones y permisos
