Monitoreo escinde actividad caspasa-3 y la apoptosis de las células inmortalizadas oligodendrogliales utilizando células vivas, imágenes y Cleaveable Sustratos Fluorogenic-dye Después de despolarización de la membrana de potasio inducida por

Resumen

Células vivas imágenes de la apoptosis mediada por la caspasa-3 en cultivos de células inmortalizadas N19-oligodendrocitos con el NucView 488 caspasa-3 sustrato. Esta técnica es aplicable para los ensayos de la muerte celular programada en tiempo real en una variedad de tipos de células y tejidos.

Resumen

El sistema nervioso central pueden experimentar una serie de tensiones e insultos neurológicos, que pueden tener numerosos efectos adversos que en última instancia conducir a una reducción de la población neuronal y la función. Axones dañados pueden liberar moléculas excitatorios como el potasio o el glutamato en la matriz extracelular, que a su vez, pueden producir más insultos y daños a las células gliales de apoyo incluyendo los astrocitos y oligodendrocitos ^{8, 16.} Si la lesión persiste, las células se someten a la muerte celular programada (apoptosis), que está regulada y activada por una serie de bien establecida cascadas de transducción de señales ^14. Apoptosis y necrosis de los tejidos puede ocurrir después de una lesión cerebral traumática, la isquemia cerebral y convulsiones. Un ejemplo clásico de regulación de la apoptosis es dependiente de la familia de cisteína-aspartato dirigida proteasas o caspasas. Proteasas activadas incluyendo las caspasas también han sido implicados en la muerte celular en respuesta a la neuro crónicaenfermedades degenerativas como el Alzheimer, Huntington, esclerosis múltiple y ^{4, 14, 3, 11, 7.}

En este protocolo se describe el uso de la NucView 488 caspasa-3 sustrato para medir la velocidad de la caspasa-3 en la apoptosis mediada por inmortalizado N19-cultivos de células de oligodendrocitos (OLG) ^{15, 5,} tras la exposición a diferentes tensiones extracelulares, tales como altas concentraciones de potasio o el glutamato. El condicionalmente inmortalizada N19-OLG línea celular (lo que representa el progenitor O2A) se obtuvo del Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Instituto de Neurociencias) ^{15, 5,} y ha sido utilizado previamente para estudiar los mecanismos moleculares de la expresión génica de mielina y la transducción de la señal principal OLG a la diferenciación (por ejemplo, ^{6, 10).} Hemos encontrado que esta línea celular para ser robusto con respecto a la transfección con exógenos proteína básica de mielina (MBP) construye fusionado a GFP o RFP o (rojo o proteína verde fluorescente) ^13,12. En este caso, los cultivos celulares N19-OLG fueron tratados con 80 mM de cloruro de potasio o de sodio 100 mM de glutamato para imitar las fugas axonal en la matriz extracelular para inducir la apoptosis ^9. Se utilizó un bi-funcional de la caspasa-3 que contiene un sustrato DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspasa-3 subunidad de reconocimiento y un tinte de unión al ADN ^2. El sustrato rápidamente entra en el citoplasma, donde es degradado por la caspasa-3 intracelular. El medio de contraste, NucView 488 se libera y entra en el núcleo celular donde se une el ADN y el verde fluorescente a 488 nm, lo que indica la apoptosis. El uso de la NucView 488 caspasa-3 sustrato permite células vivas imágenes en tiempo real ^{1, 10.} En este video, también se describe el cultivo y la transfección de células inmortalizadas N19-OLG, así como células vivas, las técnicas de imagen.

Protocolo

1. La descongelación y el cultivo de células

1. Obtener un balance de congelados inmortalizado N19-oligodendroglial células de largo plazo, las tiendas de nitrógeno líquido.
2. Sumerja vial que contiene las células a 37 ° C baño de agua hasta que la suspensión de células esté completamente descongelado.
3. 7 ml de DMEM (Dulbecco Modificado Medio de Eagle) con alta glucosa suplementado con 10% de SFB (suero fetal bovino) y 1% de penicilina / estreptomicina a una placa de 10 cm de la cultura.
4. Añadir la célula de suspensión, gota a gota a la placa, y agitar suavemente y el rock de la placa de Petri para dispersar las células de manera uniforme.
5. Las células de cultivo a 34 ° C / 5% CO ₂ incubadora.
6. Después de 4 horas, los medios de comunicación aspirado de las placas para eliminar cualquier resto de DMSO (dimetilsulfóxido), que había sido utilizado como un crioprotector, y reemplazar con medio fresco (7 ml DMEM alto de glucosa en medios suplementados con 10% de SFB y 1% de penicilina / estreptomicina) .

2. Las células pases

1. En un 70-80%confluencia (4-7 días de crecimiento), aspirar los medios de comunicación de las células.
2. Añadir 1 ml de tripsina al 0,25% a la placa. Pipeta la tripsina para separar las células (aproximadamente 5 minutos).
3. Realizar las diluciones adecuadas para las condiciones experimentales y el paso de un adicional de 10 cm de la placa para futuros experimentos a una densidad celular no menos de 0,1 x 10 ⁶ células / ml.

Nota: Es necesario el paso a las células por lo menos dos veces después de la descongelación antes de usarlos para experimentos.

3. Contar y Revestimiento células

1. A las células de la placa de células vivas, imágenes, trypsinize como se describió anteriormente.
2. Quite aproximadamente 30 l de las células y el recuento con un hemocitómetro.
3. Coloque un cubreobjetos de vidrio sin recubrimiento en una placa de 6 pocillos. Agregar celdas a la pocillos a una densidad de 0,1 x 10 ⁶ células / ml en 2 ml de fenol libre de DMEM alto de glucosa en los medios de comunicación, suplementado con FBS al 10% y el 1% de penicilina / estreptomicina, a los 34 ° C / 5% CO _2.
4. Permitirlas células a crecer durante la noche (16-20 h) a 34 ° C / 5% de CO ₂ antes de la transfección.

4. Transfección

1. Combine 100 l medio libre de suero, 0.5-4 mg purificada ADN plásmido, y 4 l HD FuGENE (Roche). Vortex suavemente para mezclar.
2. Vortex de nuevo brevemente y permitir que el ADN al complejo por 5 min a temperatura ambiente, y luego añadir FuGENE mezcla de ADN de alta definición directamente en las células cultivadas. Incline la placa suavemente para mezclar.
3. Cultivar las células durante 48 horas a 34 ° C / 5% de CO ₂ antes del tratamiento o la experimentación.

5. Las células para la preparación de imágenes de células vivas (LCI)

1. Encienda el LCI Chamlide células vivas, caja de control de instrumentos por lo menos 1 hora antes de que desea iniciar el experimento. La caja de control regula la temperatura y la humedad dentro de la Chamlide LCI, y regula el flujo de la premezcla 5% de CO _2.

Nota: Es aconsejablea su vez en la caja de control de hasta 3 horas antes del comienzo experimentos para asegurarse de que toda la etapa alcanza 34 ° C. Este paso será reducir la deriva de coordinación, que es causada por fluxulation y la expansión térmica de la fase de metal que se calienta, durante la exploración.

2. Trabajar en una campana de flujo, rocíe el Chamlide de tipo magnético cámara de cultivo, y las pinzas, con el 70% de etanol y dejar que se sequen durante 5 minutos.
3. Eliminar las células de la incubadora y confirmar que están sanos. Deben aparecer adherente y bien extendidas sobre el portaobjetos de vidrio con numerosos procesos de membrana. Las células que se destacó de la transfección no son adecuados para la experimentación, y tendrán una reducción del número de extensiones de proceso, y con frecuencia tienen un núcleo de forma irregular.
4. La inclinación de la placa de 6 pocillos y retirar el cubreobjetos con unas pinzas. Rápidamente coloque el lado de células cubreobjetos hasta en la placa inferior de la cámara de cultivo. No permita que el cubreobjetos se sequen.
5. Conecte el magnético principalcuerpo de la cámara de cultivo y añadir 500 l de los medios de comunicación a partir de los 6 originales y placa en la parte superior del cubreobjetos. Re-utilizando este medio para disminuir la cantidad de tensión puesta en las células causados ​​por cambios ambientales, y también puede ser útil para la evaluación de factores secretados extracelular.
6. Coloque la tapa de cristal en la cámara de cultivo.
7. Use un KIMWIPE rociado con etanol al 70% para eliminar cualquier material residual de la parte inferior del cubreobjetos, que podría interferir con el microscopio.
8. Coloque la cámara de cultivo en los 34 ° C / 5% incubadora de CO ₂ durante 30 minutos. Este paso se asegurará de que la propia cámara se calienta a 34 ° C para reducir el desplazamiento del cubreobjetos ya que el metal se calienta.

6. Configuración del microscopio

Las imágenes fueron adquiridas aquí usando un microscopio Leica DMIRE2 invertida con una lente de relé de la costumbre y de emisión de la vivienda rueda de filtros de cartucho de carga de ruedas múltiples (Quorum Technologies Inc., Guelph, ON).

1. Campo claro - de luz en 2,5 V y el tiempo de exposición a 240 ms.
2. Proteína fluorescente roja (RFP) - Ganancia fijado en 140 por 200 ms.
3. La proteína verde fluorescente (GFP) - Ganancia fijado en 140 por 500 ms.
4. Nuestro microscopio tiene una lámpara regulable en lugar de un disco giratorio para controlar la cantidad de luz disponible para las células. Realizamos nuestros experimentos con la luz en un 90% de la intensidad máxima de la lámpara.

7. El tratamiento de células con inductores de apoptosis y NucView 488 sustrato de la caspasa-3

1. Es importante preparar grandes cantidades de inductores de la apoptosis antes de tiempo y congelar en alícuotas, de modo que las concentraciones serán consistentes entre los experimentos.
2. El NucView 488 sustrato es sensible a la luz. Preparar alícuotas de 15 l para reducir los tubos de congelación / descongelación, y guardar a -20 ° C cubierto con papel de aluminio. Trabajo con la iluminación ambiental de la sala lo más bajo posible para reducir la exposición de la NucVea 488 de sustrato a la luz, antes de su uso.
3. Recuperar la cámara de cultivo rápido de la incubadora para que las células no están expuestos a una reducción de la temperatura. Coloque la cámara de cultivo en la cámara ambiental del microscopio, y el uso de pinzas para mantener la cámara de cultivo que se mueva. En este punto también debe atenuar las luces de la habitación.
4. Encienda el 5% premezcla cilindro de CO ₂ con regulador dual.
5. Usando el objetivo de 10x, enfoque para encontrar células en el monitor de la computadora usando el microscopio de campo brillante. Nota: usted desea utilizar la mayor apertura numérica del objetivo con la ampliación deseada para reducir el tiempo de exposición.
6. Ofrecer inductores de la apoptosis de las células (en nuestro caso, potasio 80 mM o 100 mM de glutamato), uno de los siguientes métodos se pueden utilizar. Vamos a recurrir a la entrega de potasio 80 mM como un ejemplo, utilizando KCl disuelto como un concentrado de 10 veces en nuestros medios de comunicación la cultura típica.
   1. Medios de intercambio by lenta y locales de perfusión:
      - Use una bomba peristáltica a los medios de cambio en la cámara de cultivo con nuevos medios de comunicación que contiene 80 mM de potasio.
      - Uno de los extremos de la tubería ofrecerá 10 ml de un stock de 80 mM de potasio disuelto en fenol libre de DMEM, y el otro extremo de la tubería se extraiga material de la cámara.
      - Usted quiere que por lo menos un cambio 10 veces de los medios de comunicación para asegurar que los medios de comunicación quedan en la cámara tiene la concentración correcta de potasio.
      - Después de los medios de comunicación se intercambia, añadir 3 l de 488 NucView sustrato a los medios de comunicación en la cámara. Pipeta para mezclar.
   2. Adición directa de 80 mM de K ⁺ y 488 NucView sustrato a los medios de comunicación en la cámara de la cultura:
      - Preparar una solución madre 10 veces más de potasio 80 mM disuelto en fenol libre de DMEM.
      - Añadir 3 l de 488 NucView sustrato a 50 l de potasio 10x 80 mm. Pipeta para mezclar. Añadir a 500 l de fenol-DMEM libre en cámara de cultivo.
      Nota: este método espreferible si usted está interesado en el mantenimiento o la evaluación del crecimiento u otros factores secretados que pueden estar presentes en los medios de comunicación original. Hemos encontrado que el 488 NucView sustrato es estable en el cultivo de células para los experimentos que dura hasta 36 h.

8. Imágenes de células vivas

1. Haga clic en el canal rojo para mostrar las células transfectadas.
2. Seleccionar y guardar alrededor de una docena de cuadros donde hay varias células transfectadas, y guardar estos "puntos XY etapa". Dependiendo de la cantidad de memoria del ordenador, es posible que se limita al número de puntos de la etapa que va a ser capaz de adquirir.
3. Tienen las imágenes de la captura de microscopio (en campo claro, canal rojo y canal verde) en estas etapas guardan puntos cada 6 minutos.
4. Alguna mancha verde que es visible durante las primeras etapas de los experimentos de probabilidades indica que las células que ya están sometidas a la apoptosis, por lo general para la transfección y / o el estrés ambiental. Apoptosis, debido a los tratamientos experimentales se detectó en un punto de tiempo después del experimento.

9. Análisis estadístico

1. Para cada experimento, se programa el microscopio para adquirir varios puntos de XY para reunir un gran conjunto de datos de manera eficiente. Cada experimento se realiza por duplicado o triplicado, y compilar los datos de distintos experimentos realizados en días diferentes. Cada conjunto de datos, se analizan hasta 15 campos de ver y comparar la relación de la caspasa-negativos células de la caspasa-células positivas (número total de células en el campo de visión / número total de la caspasa-células positivas).

2. Las medidas registradas por cada conjunto de datos se agrupan en un conjunto de muestras más grandes, y se comparan entre sí mediante una tabla de ANOVA (p = 0,05). Se muestran los errores estándar de la media (SEM) de cada experimento, y luego comparar la diferencia de medias mediante la realización de una prueba de comparación de los medios de Tukey (p = 0,05) para determinar quICH tratamientos son muy diferentes unos de otros.

10. Resultados representante

Hemos descrito un experimento para ilustrar cómo el NucView 488 sustrato puede indicar una mayor tasa de apoptosis de N19-OLG cultivos celulares siguiendo un tratamiento con una concentración alta de potasio extracelular. El N19-células fueron transfectadas con PP, y fueron tratados con 3 l NucView 488 substrato (control), o 3 l de sustrato NucView 488 y 80 mm [K ^+] (tratamiento). Las células fueron controlados y las imágenes fueron adquiridas en un curso de 12 h, lo cual es adecuado para los estudios con insultos neurológicos (Figura 1A). En las condiciones de control, no observamos una cantidad significativa de apoptosis en comparación con el 80 mM [K ^+] cultivos tratados (cuadro hash), que mostró aproximadamente 45% la muerte celular después de 12 h (fig. 1B). La luz verde de fondo observard en las condiciones de control indica que las células que se someten a la apoptosis, sin la adición de potasio extracelular. Prácticamente ninguna de las células de la apoptosis de control de exhibición experimento por el punto de tiempo de 12 h, aunque en otras situaciones, los experimentos pueden ser obligados a largo plazo. Las imágenes fueron adquiridas con un objetivo de 10x. Bar = 100 micras.

Figura 1. (A) Un tiempo de 12 h experimento curso de N19 culturas OLG 48 h después de la transfección expresan RFP-MBP (canal rojo) junto con 3 l de 488 NucView sustrato (canal verde). Los cultivos fueron tratados con una concentración final de 80 mM [K ^+] (paneles de la izquierda), o ningún tratamiento en el control (paneles de la derecha). Las imágenes fueron adquiridas en intervalos de 6 minutos, y la activación significativa de exfoliados caspasa-3 (señal verde) se puede observard en los cultivos tratados con 80 mM [K ^+] dentro de los núcleos celulares (cuadro de hash) en comparación con el experimento de control. (b) Porcentaje de la caspasa-3 cortado las células (que se calcula dividiendo el número total de células en el campo de visión el número total de la caspasa-células positivas). En comparación con el control de las condiciones, se observó un 45% la muerte celular después de K ^{+-tratamiento} por 12 h.

S-Video 1. Un tiempo de 12 h por supuesto experimento de N19-OLG culturas 48 h después de la transfección expresan RFP-MBP (canal rojo), con 3 l de 488 NucView sustrato (canal verde), junto con brillantes imágenes de campo y una de tres vías imagen fusionada, tras el tratamiento con 80 mM [K ^+].

S-Video 2. Un tiempo de 12 h por supuesto experimento de N19-OLG culturas 48 h después de la transfección expresan RFP-MBP (canal rojo), con 3 l de 488 NucView sustrato (canal verde), junto con el campo brillante images y una imagen de tres vías combinadas. No hay un tratamiento se aplicó a las culturas y N19-OLGs se puede ver a través de la migración campo del microscopio, en contraste con los cultivos celulares tratados con 80 mM [K ^+] (comparar con el S-Video 1).

Discusión

Aunque este no es el único producto disponible para fluorogénico detección de la apoptosis, hay varias ventajas de utilizar el sustrato NucView 488. Una de las principales ventajas es la capacidad de seguir la apoptosis en células vivas en tiempo real, mientras que la mayoría de los productos alternativos o bien requieren la lisis celular o la permeabilidad celular pobres. Otros beneficios incluyen una alta sensibilidad para el reconocimiento de la caspasa-3, la permeabilidad celular de alta, baja citotoxicidad, y no hay interferencia con la progresión de la apoptosis. El sustrato también tiene antecedentes de fluorescencia bajo hasta que se rompe y entra en el núcleo, lo que elimina la fluorescencia de fondo. La secuencia de reconocimiento de la caspasa-3 contiene tres cargas negativas y el tinte de unión al ADN tiene una carga positiva ^2. El DEVD-NucView 488 molécula por lo tanto tiene una carga neta negativa, lo que impide la activación y la unión del colorante en el ADN en las células donde no está activa la caspasa.

Maintaining consistencia entre los experimentos se requiere para poder hacer comparaciones significativas entre repeticiones. Uno de los principales parámetros para mantener constante es la densidad celular, ya que afecta a la tasa de transfección. La obtención de altas tasas de transfección en inmortalizado N19-OLG cultivos celulares es más difícil que con otras líneas celulares comunes, tales como HeLa o HEK293, y es altamente dependiente de la densidad, en nuestra experiencia, ^{12, 13.} Nuestra mejor eficiencia de transfección de estas células se han obtenido con Fugene HD (Roche) y normalmente son alrededor del 15%, pero puede llegar a más del 30%, dependiendo de la construcción. Recuento de células cuidado ayudará en la obtención de tasas consistentes de transfección. También es importante para exponer las células a partir de diferentes tratamientos en el mismo grado de estrés ambiental, especialmente en la medición de los índices de apoptosis. En concreto, la longitud de tiempo durante el cual las células son expuestas a reactivos de transfección, o la cantidad de exposición a la luz, son importantes variables ambientalesvariables a considerar, y debe seguir siendo constante a través de experimentos. Para nuestras aplicaciones, hemos encontrado que la recopilación de un gran número de campos de visión proporciona un tamaño de muestra suficientemente grande como para hacer comparaciones estadísticamente significativa [ibid].

Materiales

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
NucView 488 Kit de caspasa-3 ensayo de células en vivo	Biotium	30029
FuGENE HD reactivo de transfección	Roche	04709705001
Dulbecco Modificado Medio Eagle	Gibco	31053-028
0,25% de tripsina	Gibco	15050-065
El suero fetal bovino	Gibco	12483-020
Penicilina / estreptomicina	Gibco	15140122
# 1.5-25 mm de vidrio cubreobjetos	Warner Instrumentos	64-0715
Chamlide CMB magnética cultura de la cámara de 25 mm cubreobjetos	Tecnologías de quórum	CM-B-40
Cellstart cultivo de tejidos platos de 10 cm	VWR	82050-576
BD Falcon 6-y platos de cultivo de tejidos	VWR	CA62406-161