Se describe un método relativamente simple de transretinal electrorretinograma (ERG) para la obtención de grabaciones photoresponses conos y bastones de la retina del ratón intacto. Este enfoque se aprovecha del bloque de la transmisión sináptica de fotorreceptores para aislar sus respuestas de luz y grabar usando electrodos colocados sobre el terreno a través de la aislada plana montada en la retina.
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Artículo de método
Transretinal Grabaciones ERG de retina del ratón: Rod y el Cono Photoresponses
En este artículo
Resumen
Resumen
Hay dos clases distintas de formación de la imagen-los fotorreceptores de la retina de los vertebrados: los bastones y conos. Los bastones son capaces de detectar fotones individuales de luz, mientras que los conos de funcionar de forma continua en las cambiantes condiciones de luz brillante. La absorción de luz por la A-Rod y específicos de cono pigmentos visuales en los segmentos externos de fotorreceptores desencadena una cascada de fototransducción que finalmente conduce al cierre de los nucleótidos cíclicos-bloqueados los canales de la membrana plasmática y la hiperpolarización de la célula. Este cambio inducido por la luz en la membrana de actuales y potenciales pueden ser registrados como una foto-, ya sea por 1,2 de electrodos de aspiración clásica técnica de grabación o grabaciones transretinal electrorretinograma (ERG) de retinas aisladas con componentes farmacológicamente bloqueados respuesta postsináptica 3-5. Este último método permite drogas accesibles duraderos grabaciones de fotorreceptores de ratón y es particularmente útil para obtener photoresponses estables from los conos de ratones escasos y frágiles. En el caso de los conos, estos experimentos se puede realizar tanto en las condiciones adaptados a la oscuridad y la iluminación intensa siguiente que blanquea prácticamente todos pigmento visual, para supervisar el proceso de recuperación de cono de fotosensibilidad en adaptación a la oscuridad 6,7. En este video, vamos a mostrar cómo llevar a cabo de vara y M / L de cono-impulsadas por las grabaciones de transretinal adaptada a la oscuridad retina del ratón. Grabaciones Rod se llevó a cabo utilizando retina de tipo salvaje (C57BL / 6) ratones. Por simplicidad, las grabaciones de cono se obtendrá a partir modificado genéticamente varilla transducina α-subunidad extractor (Tα - / -) ratones que carecen de barra de señalización 8.
Protocolo
1. Haciendo electrodos
- Preparar electrodos de vidrio. Pesar 120 mg de agar y se mezcla en 10 ml de agua destilada (concentración final de 1,2% de agar). Derretir la solución de agar en un baño de agua caliente. Llenar capilares de vidrio (que se usen instrumentos de Word Presision TW100-4 capilares con las siguientes dimensiones: longitud = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm, y el volumen interno = 44 l) con la solución de agar con una jeringa de plástico. Solidificar el agar a temperatura ambiente durante 10 min. Así, hasta ~ 200 capilares puede ser llenado (el resto de la mezcla de agar puede ser almacenado a -4 ° C y reutilizados varias veces).
- Corta....
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Discusión
El método de los bastones, los conos y las grabaciones basadas en transretinal-ERG se ha descrito anteriormente se está convirtiendo en una poderosa herramienta para la investigación de la función de los fotorreceptores de ratón en el tipo salvaje y animales modificados genéticamente. Además de la caracterización de las propiedades de fácil fotorrespuesta básicos, esta técnica simple proporciona estabilidad durante gran respuesta de larga duración experimentos realizados en preparaciones retina cercana al intactas. Tant.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Con el apoyo de premio a la Trayectoria para el Desarrollo de la Investigación y Prevención de la Ceguera, las subvenciones del NIH EY19312 y EY19543 (VJK), así como por la subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera y la EY02687 (Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales de la Universidad de Washington).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Nombre del Material | Tipo | Empresa | Número de catálogo | Comentario |
| DL-AP-4 | Biociencia Tocris | 0101 | ||
| Todos los demás reactivos | Sigma-Aldrich | |||
| Capilares de vidrio | World Precision Instruments | TW100-4 | Para hacer electrodos | |
| Papel de filtro | HARG | Millipore | HABG01300 | |
| Fotómetro | UDT Instruments | S350 | Para la calibración de la luz | |
| Sensor de silicio radiométrica | UDT Instruments | 221 | Para la calibración de la luz | |
| Anti-vibración de mesa | Técnico Manufacturing Corporation | TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 | Para reducir al mínimo el ruido mecánico | |
| Compresor de aire Pantera P 15TC | Werther Internacional | P 15TC | Conectado a la mesa anti-vibración | |
| Estereomicroscopio | LEICA | MZ9.5 | Para la disección del ratón ocular | |
| Convertidores de imagen por infrarrojos | BEMeyers | ProwlerTM | Ligado a estereomicroscopio | |
| Amplificador diferencial DP-311 | Warner Instruments | DP-311 | ||
| Axon Digidata 1440A digitalizador | ; | Molecular Devices | 1440A | |
| Dual Channel de 8 polos del filtro | Krohn-HITE Corporación | 3382 | ||
| Resistencia de cerámica | TE Conectividad | CGS SBCHE618RJ | Para recalentar la solución de perfusión | |
| Termopar | T | Physitemp Instruments | TI-18 | |
| Monitor de temperatura | Omega | DPi32 | Conectado a un termopar | |
| LED de 505 nm | TT Electronics / Optek Technology | Digi-Key P / N 365-1185-ND | Para aplicar destellos de luz de prueba o de blanqueo | |
| Pluma de cauterización | Bovie | AA25 | Para marcar la parte dorsaldel globo ocular ratón | |
| pCLAMP 10 Electrofisiología de Adquisición de Datos y Análisis | Molecular Devices |
Referencias
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- an....
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Reimpresiones y permisos
