RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

Resumen

Se describe un método sensible para identificar a los reguladores postembrionario de expresión de la proteína y su localización en C. elegans Con una pantalla de genómica basada en RNAi y un transgén integrado que expresa una proteína funcional, con fluorescencia etiquetados.

Resumen

C. elegans ha demostrado ser un sistema modelo valioso para el descubrimiento y caracterización funcional de muchos genes y ¹ vías genéticas. Herramientas más sofisticadas y los recursos para los estudios en este sistema están facilitando continuo descubrimiento de los genes con los fenotipos más sutiles o roles.

Aquí se presenta un protocolo generalizado hemos adaptado para la identificación de C. elegans genes con fenotipos postembrionarios de interés utilizando RNAi ^2. Este procedimiento se puede modificar fácilmente para ensayar el fenotipo de elección, ya sea por la óptica de luz o de fluorescencia en un microscopio de disección o compuesto. Este protocolo de cribado saca provecho de los activos físicos del organismo y las herramientas moleculares de la C. elegans comunidad de investigación ha producido. Como un ejemplo, se demuestra el uso de un transgén integrado que expresa un producto fluorescente en una pantalla de ARNi para identificar los genes necesarios para la localización normal de esteproducto en las larvas de fase tardía y adultos. En primer lugar, hemos utilizado una biblioteca genómica disponible en el mercado con el RNAi de larga duración en insertos de cDNA. Esta biblioteca facilita la rápida identificación de los múltiples candidatos por la reducción de RNAi el producto del gen candidato. En segundo lugar, hemos generado un transgen integrado que expresa nuestra proteína fluorecently etiquetado de interés en un fondo de RNAi y minúsculas. En tercer lugar, mediante la exposición de los animales nacidos de RNAi, esta pantalla permite la identificación de los productos de los genes que tienen un papel vital embrionaria que podría ocultar un papel post-embrionario en la regulación de la proteína de interés. Por último, esta pantalla utiliza un microscopio compuesto equipado para la resolución de células individuales.

Protocolo

1. Detección construcción de la cepa

El diseño cuidadoso de la cepa de detección es crítico para el éxito de la pantalla y se ha descrito en otra parte ^3. Para algunos investigadores, utilizando una cepa que expresa un producto visible de un transgén que se necesita para el experimento. Muchas cepas que albergan los transgenes integrados están disponibles en los investigadores CGC o individual. Si una cepa transgénica se requiere para la pantalla pero no está disponible, entonces se pueden generar mediante un método publicado como bombardeo ^4, UV / TMP ^5, o MOS transposón inserción ^6. Con el fin d....

Discusión

El método de cribado ARNi presentado aquí permite un análisis sensible y rápido de los productos de genes necesarios para una normal (o transgénicos) fenotipo postembrionario. El ejemplo que se muestra es una pantalla de genes implicados en la localización subcelular de una proteína fluorescente etiquetados. Sin embargo, este protocolo puede ser modificado para identificar los genes que afectan a otros fenotipos postembrionario de interés.

Este método tiene la ventaja de un enfoque de genes .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NGM agar	Nematodos medio de crecimiento	MIP Scientific, Inc	Se puede preparar siguiendo el protocolo de agar NGM 25
Medio M9	22mm KH 2 PO 4, 42mm de Na 2 HPO 4, 86mm de NaCl, 1 mM de MgSO 4		26
Agar agar	EMD Chemicals Inc.	1.01614.1000	2% en agua para placas NGM. 4% en agua para almohadillas portaobjetos de microscopio (autoclave inicialmente y microondas para fundir posteriormente).
Bacto peptona	Becton Dickinson - Difco CP	211677	0,25%
IPTG	Investigación de Productos International Corp.	I56000-5.0	1 mM de concentración final
carbenicilina	Investigación de Productos International Corp.	C46000-5.0	50 ug / ml de la dilución de trabajo
LB caldo Lennox	Becton Dickinson - Difco CP	240230	20 g / litro
tetraciclina	Sigma	268054	12,5 mg / ml de la dilución de trabajo
hipoclorito de sodio	Cualquier marca	5% de lejía	Use cloro libre.
de hidróxido de sodio	Cualquier marca	CAS 1310-73-2	5 N de valores
Medio M9	Wormlab Libro de Recetas	http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab	26
levamisol	Sigma	31742	100 mM mM - una dilución de trabajo
azida de sodio	Fisher Scientific	S227	10 mM en M9 dilución de trabajo
24-pocillos	Greiner Bio-One	662160	VWR distribuidor
portaobjetos de microscopio	Cualquier marca	75 x 25 x 1 mm
se desliza la cubierta del microscopio	Cualquier marca	22 x 22 mm No.1.5	Utilizar el espesor recomendado por el fabricante del microscopio.
microscopio compuesto	Carl Zeiss, Inc.	A1m	Utilice objetivos y filtros para que coincida con las necesidades del experimento.
los medios de comunicación de la bomba	Manostat Varistaltic bomba	Kate modelo # 72-620-000	Use tubería y ajustes adecuados para la máquina