RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

Resumen

Se describe un método sensible para identificar a los reguladores postembrionario de expresión de la proteína y su localización en C. elegans Con una pantalla de genómica basada en RNAi y un transgén integrado que expresa una proteína funcional, con fluorescencia etiquetados.

Resumen

C. elegans ha demostrado ser un sistema modelo valioso para el descubrimiento y caracterización funcional de muchos genes y ¹ vías genéticas. Herramientas más sofisticadas y los recursos para los estudios en este sistema están facilitando continuo descubrimiento de los genes con los fenotipos más sutiles o roles.

Aquí se presenta un protocolo generalizado hemos adaptado para la identificación de C. elegans genes con fenotipos postembrionarios de interés utilizando RNAi ^2. Este procedimiento se puede modificar fácilmente para ensayar el fenotipo de elección, ya sea por la óptica de luz o de fluorescencia en un microscopio de disección o compuesto. Este protocolo de cribado saca provecho de los activos físicos del organismo y las herramientas moleculares de la C. elegans comunidad de investigación ha producido. Como un ejemplo, se demuestra el uso de un transgén integrado que expresa un producto fluorescente en una pantalla de ARNi para identificar los genes necesarios para la localización normal de esteproducto en las larvas de fase tardía y adultos. En primer lugar, hemos utilizado una biblioteca genómica disponible en el mercado con el RNAi de larga duración en insertos de cDNA. Esta biblioteca facilita la rápida identificación de los múltiples candidatos por la reducción de RNAi el producto del gen candidato. En segundo lugar, hemos generado un transgen integrado que expresa nuestra proteína fluorecently etiquetado de interés en un fondo de RNAi y minúsculas. En tercer lugar, mediante la exposición de los animales nacidos de RNAi, esta pantalla permite la identificación de los productos de los genes que tienen un papel vital embrionaria que podría ocultar un papel post-embrionario en la regulación de la proteína de interés. Por último, esta pantalla utiliza un microscopio compuesto equipado para la resolución de células individuales.

Protocolo

1. Detección construcción de la cepa

El diseño cuidadoso de la cepa de detección es crítico para el éxito de la pantalla y se ha descrito en otra parte ^3. Para algunos investigadores, utilizando una cepa que expresa un producto visible de un transgén que se necesita para el experimento. Muchas cepas que albergan los transgenes integrados están disponibles en los investigadores CGC o individual. Si una cepa transgénica se requiere para la pantalla pero no está disponible, entonces se pueden generar mediante un método publicado como bombardeo ^4, UV / TMP ^5, o MOS transposón inserción ^6. Con el fin de visualizar nuestra proteína de interés, que inserta la secuencia de codificación de las buenas prácticas agrarias en el marco con la secuencia de ADNc maduro (que utiliza DBL-1 secuencia). Debido a que esta proteína de fusión GFP no es visible mediante la disección de alcance, se utilizó un marcador de coinyección que era visible y no afectará a la visualización de nuestra proteína de interés (TTX-3p :: rfp 7). Entonces creamos un transgén integrado de la matriz extracromosómico. Hemos encontrado que el bombardeo del transgén dado una copia de baja el número de línea integrado que ni rescatado el fenotipo microscopio de disección, ni produce los niveles visibles de productos con etiquetas de las buenas prácticas agrarias (Beifuss y Gumienny, no publicado). UV / TMP integración de una matriz de copia múltiple extracromosómico originalmente hecha por inyección ^8,9 cedido visibles, rescatar los niveles de producto transgénico (Figura 3A). Western blot con anticuerpos anti-GFP confirmó que el transgen (nombre alelo texIs100) se expresa y se procesa correctamente (Beifuss y Gumienny, no publicado). Transgenes integrados deberían ser outcrossed cinco veces para eliminar las mutaciones extrañas de fondo sin importar la fuente.

Por nuestra pantalla, queríamos que la única proteína de interés como la forma transgénica, etiquetado. Por lo tanto, hemos eliminado el G endógena funcionaleno mediante la introducción de una pérdida de función mutante DBL-1 alelo.

Finalmente, la cepa sensibilizado a los efectos de ARNi. El ARNi de la biblioteca, por muchos genes, una reducción más severa en el producto del gen si los animales contienen una mutación que sensibiliza a los animales a los efectos de RNAi ^10,11 El tejido (s) de interés debe ser considerado al momento de elegir una adecuada RNAi sensibilizar a fondo ^11. Se utilizó el alelo canónico FRR-3 (pk1426) para hacer que nuestra cepa de selección. FRR-3 es un ARN polimerasa dirigida por ARN (RDRP) homólogo que normalmente inhibe somática ARNi ^10. Las mutaciones en otros genes RNAi hypersensitizing como eri-1 o eri 1-Lin-15b puede utilizarse en lugar de aumentar la eficacia de la ARNi ^11-13.

La cepa de selección que hicimos tiene el genotipo FRR-3 (pk1426); texIs100; DBL-1 (NK3).

2. Elección y preparación deRNAi biblioteca

Comercialmente disponible C. las bibliotecas de cDNA elegans representan alrededor del 55% o el 87% de los genes predichos en C. elegans individual (Vidal laboratorio o bibliotecas Ahringer de laboratorio, respectivamente). Clones individuales están disponibles para su compra (Open Biosystems, Geneservice, Ltd.). Elegimos la biblioteca ORF-RNAi construido por el laboratorio de Vidal (Open Biosystems), ya que sus clones son en su mayoría de larga duración de puerta de enlace ADNc clonado y listo para aplicaciones posteriores (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). El original Ahringer biblioteca genómica de laboratorio ADNc contiene fragmentos de cDNA que no son tan ampliamente útil para los experimentos de caracterización de aguas abajo ^14,15. Las dos bibliotecas usar un vector que contiene dos promotores T7 flanquean la inserción (Figura 1). Las construcciones se cultivan en la cepa bacteriana HT115, que expresa la polimerasa T7 a la inducción por isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG). Las bacterias que contienen clones de la biblioteca se inducen con IPTG aproducción de dsRNA (ver Paso 3.4).

Duplicar la biblioteca completa al recibir y utilizar el duplicado de todos los experimentos. Las bibliotecas de originales y duplicados deben ser almacenados en diferentes -80 ° C congeladores que están conectados para separar las líneas eléctricas.

3. Preparación de las bacterias con los clones de la biblioteca

1. (En los dos meses del experimento) bacterias Streak de clones seleccionados de alimentación de la biblioteca, así como controles positivos y negativos, en la etiqueta carbenicilina LB / tetraciclina (placas crecemos 8 culturas por placa de 100 mm) y se incuba a 37 ° C durante la noche ( > 16 horas) (Figura 1). Por cada placa de 24 pocillos, se utilizan dos controles. El control positivo, bli-4 (K04F10.4), produce una dosis-dependiente post-embrionario pheontype ^16,17. El control negativo, C06C3.5, es un pseudogen predicho ( WormBase.org ) que no causa fenotipos observados (Beifuss y Gumienny, no publicado).
(En los dos meses del experimento, preferiblemente antes) Preparar de 24 y medio de crecimiento de nematodos (NGM) las placas que contienen 25 a 50 mg / ml de carbenicilina y IPTG 1 mM. Almacenar a 4 ° C.
2. (Día 1) Para cada clon, inocular 2 ml conteniendo medio LB 50 g / ml de carbenicilina con una sola colonia de la placa de rayado (s) (en el Paso 3,1) utilizando una técnica estéril estándar. Incubar a 37 ° C durante la noche (> 16 horas) en un conjunto agitador a 220 a 240 rpm (Figura 1). La solución debe ser turbia después de 16 horas.
3. (Día 2) A la mañana siguiente, inducir ARN de doble cadena (dsRNA) producción por adición de IPTG a los cultivos a una concentración final de 1 mM. Incubar los cultivos a 37 ° C, 220 - 240 rpm, por un período adicional de 4 - 5 horas. Este paso asegura una más consistente y robusta ARNi inducida desmontables de producto del gen de confiar únicamente en el IPTG en el agar de la placa NGM (en el Paso 3,5).
4. Spot de 30 l de cada cu bacterianas inducidaslture en pocillos separados de una placa de 24 pocillos NGM RNAi que contiene 25 a 50 mg / ml de carbenicilina y 1 mM de IPTG (Figura 1, véase la Figura 4 para la plantilla utilizada para realizar un seguimiento de experimentos de RNAi). Ponga las placas, sin tapar, en una campana de flujo estéril durante 20 minutos o hasta que las manchas bacterianas están secos. No seque en demasía. Secar en exceso provoca que los bordes del agar a separarse de la placa y los animales será irrecuperable si se arrastran en las grietas resultantes.

4. Preparación de los nematodos

Comience con una población de nematodos en escena. La estadificación animales disminuye la posibilidad de que las diferencias observadas entre el control y los ensayos experimentales RNAi son simplemente debido a diferencias en la etapa de desarrollo de los animales (sin embargo, si el RNAi causa un retraso en el desarrollo, esto debe ser observado por el agente de control (Figura 2)) . Además, a partir del experimento con las larvas L1 RNAi evita los posibles efectos de confusión de la letalidad embrionaria de RNAi de la generaciónes que también pueden jugar un papel postembrionario de interés.

La estadificación se lleva a cabo por primera blanqueo una población mixta-etapa de la cepa de detección, que sólo la cáscara del huevo-protegidas embriones sobrevivir. Estos escenarios a los animales en aproximadamente 12 horas a 20 ° C o 18 horas a 16 ° C ^18. Para los animales con más fuerza la etapa, los animales de detención en el primer estadio larval (L1) al permitir que los embriones eclosionan en el medio M9 sin alimentos. Animales muertos de hambre L1 colocado en el crecimiento de los alimentos hoja de vida de la misma edad de partida ^19.

1. (Día 1) El uso de tres placas de 100 mm de animales alimentados, limpios de detección de tensión que contienen adultas grávidas y embriones. Lave los animales de las cajas con M9 estéril por pipetear líquidos a través de la superficie de la placa suavemente para soltar los animales y embriones. Transferir el lavado en un tubo estéril 15 ml con tapón de rosca.
2. Si el lavado es mayor que 3,5 ml, la desaceleración de los animales (~ 3000 rpm durante 30 segundos) y extraer líquido de 3,5 ml. Si el lavado es lESS de 3,5 ml, añadir H ₂ 0 o M9 al tubo a un total de 3,5 ml.
3. Use equipo de protección adecuado (bata de laboratorio, guantes y gafas) durante la manipulación de productos químicos. Mezclar 0,5 ml de NaOH 5 N con cloro 1 ml fresca (5% de hipoclorito de sodio, menos de 1 año de edad). Añadir esta mezcla a la de lavado de nematodos 3,5 ml. Iniciar un temporizador contando. Este proceso no debería durar más de 10 minutos. Si lo hace, entonces estará en peligro los embriones y el rendimiento puede reducirse, o la lejía es viejo y debe ser reemplazado.
4. Vortex el tubo durante unos 10 segundos. Repita el vórtex cada dos minutos durante 4 a 10 minutos. Después de cada vórtice, tenga en cuenta la solución bajo un microscopio de disección de cadáveres de animales.
5. Cuando los embriones son liberados y adultos están fragmentados (6 - 8 minutos), los embriones precipitado por hilatura del tubo en una centrífuga de mesa (~ 3000 rpm, 30 segundos).
6. Aspirar tanto del sobrenadante como sea posible sin perturbar el sedimento. Ten cuidado, nocodicioso.
7. Añadir M9 estéril a ~ 10 ml. Vortex brevemente o agitar bien para volver a suspender el pellet.
8. Haga girar y retirar el sobrenadante de nuevo. Si el olor de la lejía puede ser detectada en el tubo, repita enjuague como sea necesario.
9. Volver a suspender los embriones en 10 - 15 ml de agua estéril M9 y la transferencia a un pequeño (25 ml) erlenmeyer (para la aireación). Agitar a la temperatura adecuada para la cepa y el experimento (15 - 25 ° C) durante la noche (más de 16 horas a 20 ° C). En este tiempo, los animales nacen y todos los detenidos en la diapausa L1.
10. (Día 2) Spin pulsado L1 animales de etapa en un tubo de 15 ml y resuspender en 0,5 a 1 ml de M9 (~ 3000 rpm, 30 seg.). Coloque una solución al 5 l en un plato aparte y contar el número de animales. Realizar ajustes en el volumen, si es necesario, para producir 30 gusanos / 3 - 10 l de solución.
11. Spot aproximadamente 30 hipoclorito sincronizados animales etapa L1 sobre las bacterias en cada pocillo de la preparada 24-pocillos. Demasiados mesesre de 30 animales por así puede dar lugar a la población hambrienta antes de llegar a la madurez. Deje que la placa seca con la torcida tapas. Vuelva a colocar la tapa y asegurarla con una goma elástica. Invertir la placa y colocarla a la temperatura adecuada durante el tiempo necesario para anotar en la fase deseada. Debido FRR-3 (pk1426) es un alelo sensible a la temperatura, nuestros animales cepa de cribado se cultivaron a 15 a 17 ° C durante tres a cuatro días para observar a los animales L4 estado adulto (Figura 1).

5. La observación de los nematodos

(Día 5) Una vez que los nematodos han crecido hasta el punto deseado (Figura 2A), confirman que los controles positivos y negativos producen los fenotipos esperados mediante el uso de un microscopio de disección. Usamos bli-4 como un control de la eficacia de RNAi, ya que produce dependientes de la dosis post-embrionarias defectos que van desde los adultos con ampollas (leve fenotipo RNAi, no se muestra) para el desarrollo detenido, pequeñas larvas (e fuerte,xpected RNAi fenotipo) (Figura 2B). A continuación, observar a los animales en cada uno experimental y utilizando un microscopio de disección y fenotipos anormales nota obvias inducida por RNAi (Fig. 2C). Después de que los controles se confirman y tomó nota de los fenotipos graves, la pantalla de los experimentos de RNAi para los fenotipos de interés. Utilizamos un microscopio compuesto equipado con fluorescencia y un objetivo 63x para observar al menos cinco animales de cada experimento ARNi, comenzando con los controles (Figura 3).

1. Prepare una diapositiva (estándar de 75 x 25 mm) mediante una plataforma de agar al 4% (4% de agar en H ₂ O). Para asegurar un espesor uniforme de la almohadilla de agar, colocar un portaobjetos de vidrio limpio entre dos espaciadores (cada espaciador está hecho de un portaobjetos de microscopio con dos capas de cinta de laboratorio en él). Pipeta aproximadamente 100 l (dos a tres gotas de una pipeta Pasteur de vidrio) de agar fundido 4% en el centro de la placa de vidrio limpia. Formar una plataforma de agar, cubriendo el agar fundido con un carro adicional colocar rápidamente pero con cuidado en la parte superior de los separadores de unnd el agar fundido. Exponer la plataforma de agar deslizando suavemente los portaobjetos de vidrio separadas, dejando el teclado de la adhesión a una diapositiva.
2. Colocar una gota ~ 5 l de anestésico (levamisol o azida de sodio, por ejemplo) en la almohadilla de agar. Monte 8 - 12 animales en la anestesia. Cubrir con un 22 x 22 mm # 1,5 cubreobjetos (o el espesor de cubreobjetos más adecuado para el microscopio compuesto) y observar a los animales usando un microscopio compuesto.
3. Registro de genes, el número de animales observados, y el fenotipo de los resultados de cada experimento de RNAi. Para una pantalla, realizar y utilizar una plantilla estándar (véase el ejemplo, la Figura 5).
4. Verifique que el fenotipo RNAi fenotipo producido por otro, secundario, si es posible, y repitiendo el experimento. (Por ejemplo, la pantalla de ejemplo que se muestra utiliza la alteración de las buenas prácticas agrarias de etiquetado DBL-1 la localización como una pantalla principal y el tamaño corporal, como una pantalla secundaria ^20.) Las bacterias se pueden utilizar desde la raya misma (se almacenan a 4 ° C) durante un máximo de dos meses. Mayores rachas pueden resultado en el crecimiento de los pobres en líquido cultivos de una noche y se debe restreaked primero.
5. Secuencia al menos un extremo del inserto de ADNc para confirmar que el inserto coincide con la etiqueta de biblioteca (la biblioteca Ahringer ha tenido un análisis de fiabilidad realizado; ver http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/ ) ^21. Cebadores recomendados (para inserciones de cualquier biblioteca) recocido en los sitios en la L4440 derivada de vector y flanquean el sitio de inserción: 5'-AGCGAGTCAGTGAGCGAG-3 'y 5'-3-GTAAAACGACGGCCAGT (M13f20 imprimación).

El uso de este método, una sola persona puede razonablemente organizar y observar de dos a cuatro series de experimentos cada semana. Por ejemplo, los animales realizaron el lunes y martes se puede observar el jueves y viernes, respectivamente, y se puede volver a escena el viernes y el sábado para el lunes y la observación del martes. Dependiendo del fenotipo (s) seleccionados cada día, un conjunto puede comprender una placa de 24 pocillos por el compuesto de microexamen microscópico o más si el fenotipo es rápidamente identificado. Por lo tanto, al menos 88 diferentes experimentos de RNAi se puede observar en una semana, teniendo en cuenta los controles positivos y negativos y la tasa de detección. Una pantalla de disección podría realizarse mucho más rápidamente, sin necesidad de montaje animales en portaobjetos para su visualización. Varias personas también podrían aumentar el rendimiento de un laboratorio por el calendario de escalonamiento y / o utilizando microscopios múltiples. Un método alternativo para el cultivo de animales en una película delgada de agar y transferir una rebanada del agar que contiene animales directamente a una diapositiva para la visualización puede ahorrar tiempo. Esta variación se utilizó con éxito para la detección de anomalías en el macho de la cola 400X ^22.

6. Los resultados representativos

Ejemplos de localización normal y alterado de GFP-etiquetados DBL-1 se muestran en la Figura 3. Expresión normal de las buenas prácticas agrarias de etiquetado DBL-1 incluye nerviosas ventrales cuerpos celulares de la médula y una fila de punctae (Figura 3). DBL-1 is severamente atenuada cuando los animales son alimentados ARN que impide DBL-1 ARNm traducción (Figura 3B). DBL-1 (ARNi) también produce animales pequeños, la pantalla secundaria en este ejemplo (datos no presentados). Los genes que afectan DBL-1 localización son fácilmente identificados por RNAi utilizando una cepa diseñado para esta pantalla (Figura 3C).

Figura 1. Esquema de la pantalla para identificar a los reguladores extracelulares de DBL-1 de señalización. Las bacterias de la biblioteca de alimentación se hacen crecer durante la noche, inducidos con IPTG, y se incubaron a 37 ° C durante 4 horas adicionales para permitir que las bacterias para producir ARN de doble cadena (dsRNA). 30 l del cultivo bacteriano inducido es detectado por pocillo en un 24-así NGM (medio nematodo crecimiento) placa que contiene 25 mg / ml de carbenicilina y IPTG 1mM y se deja secar en una campana de flujo estéril. Tenemos una primera etapa etapa larval (L1) al permitir que las larvas tratadas con hipoclorito de EMBRyos se incuban en los medios de comunicación sin el alimento, lo que induce una diapausa L1 (Arrested Development). Aproximadamente 30 animales sincronizados fase L1 se colocan en cada bacteria y que contienen desde la biblioteca de RNAi, que permite a los animales en escena para reanudar el crecimiento y para consumir el dsRNA creado por los ^{23 tipos de} bacterias. Después de 72 horas a 15 ° C, los gusanos adultos jóvenes son examinados para detectar un fenotipo visible. A esta edad, los defectos de tamaño corporal son evidentes y de fluorescencia es brillante en la expresión del transgen texIs100.

Figura 2. Ejemplos de caracteres para identificar antes del examen. Todas las imágenes de los animales en una placa bien fueron tomadas en la misma ampliación utilizando un microscopio de disección. Los animales fueron estudiados todos los cerca de 72 horas después de placas en forma de larvas L1 hambre. Todas las imágenes fueron tratadas de manera idéntica. A) ARNi de un gen que da sin defectos morfológicos graves. Los animales parecen de tipo salvaje. B) RNAi de bli-4. Los animales muestran un desarrollo limitado, y son pequeños en comparación con los animales en el panel A. C) RNAi de dpy-13. Los animales se encuentran en la misma fase de desarrollo como los animales en el panel A, pero mostrar un "cochambrosa" morfología del cuerpo.

Figura 3. Ejemplos de proteína fluorescente etiquetados y cómo RNAi de genes específicos altera patrón de localización. Todas las imágenes fueron tomadas con un aumento de 630x con microscopía confocal de disco giratorio, 5 seg. exposición. Barras de escala = 10 micras. Todas las imágenes fueron tratadas de manera idéntica. Puntas de flecha indican Open cuerpos celulares. Las flechas señalan la línea de punctae. Puntas de flecha indican algunos llenos de buenas prácticas agrarias de etiquetado aberrante localizado DBL-1. A) RNAi alimentados pseudogen C06C3.5 ("wild type"). B) DBL-1 (RNAi) de control. C) RNAi de un gen necesario para la localización normal de GFP-etiquetados DBL-1.

Figura 4. Plantilla de ejemplo para el seguimiento de experimentos de RNAi (los clones de la biblioteca) en placas de 24 pocillos. Esta plantilla se puede utilizar para crear un registro permanente de los experimentos, a diferencia de etiquetado directamente placas.

Figura 5. Plantilla de ejemplo para la grabación de fenotipos RNAi. Expandir según sea necesario.

Discusión

El método de cribado ARNi presentado aquí permite un análisis sensible y rápido de los productos de genes necesarios para una normal (o transgénicos) fenotipo postembrionario. El ejemplo que se muestra es una pantalla de genes implicados en la localización subcelular de una proteína fluorescente etiquetados. Sin embargo, este protocolo puede ser modificado para identificar los genes que afectan a otros fenotipos postembrionario de interés.

Este método tiene la ventaja de un enfoque de genes ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NGM agar	Nematodos medio de crecimiento	MIP Scientific, Inc	Se puede preparar siguiendo el protocolo de agar NGM 25
Medio M9	22mm KH 2 PO 4, 42mm de Na 2 HPO 4, 86mm de NaCl, 1 mM de MgSO 4		26
Agar agar	EMD Chemicals Inc.	1.01614.1000	2% en agua para placas NGM. 4% en agua para almohadillas portaobjetos de microscopio (autoclave inicialmente y microondas para fundir posteriormente).
Bacto peptona	Becton Dickinson - Difco CP	211677	0,25%
IPTG	Investigación de Productos International Corp.	I56000-5.0	1 mM de concentración final
carbenicilina	Investigación de Productos International Corp.	C46000-5.0	50 ug / ml de la dilución de trabajo
LB caldo Lennox	Becton Dickinson - Difco CP	240230	20 g / litro
tetraciclina	Sigma	268054	12,5 mg / ml de la dilución de trabajo
hipoclorito de sodio	Cualquier marca	5% de lejía	Use cloro libre.
de hidróxido de sodio	Cualquier marca	CAS 1310-73-2	5 N de valores
Medio M9	Wormlab Libro de Recetas	http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab	26
levamisol	Sigma	31742	100 mM mM - una dilución de trabajo
azida de sodio	Fisher Scientific	S227	10 mM en M9 dilución de trabajo
24-pocillos	Greiner Bio-One	662160	VWR distribuidor
portaobjetos de microscopio	Cualquier marca	75 x 25 x 1 mm
se desliza la cubierta del microscopio	Cualquier marca	22 x 22 mm No.1.5	Utilizar el espesor recomendado por el fabricante del microscopio.
microscopio compuesto	Carl Zeiss, Inc.	A1m	Utilice objetivos y filtros para que coincida con las necesidades del experimento.
los medios de comunicación de la bomba	Manostat Varistaltic bomba	Kate modelo # 72-620-000	Use tubería y ajustes adecuados para la máquina