Este trabajo describe tres protocolos complementarios para evaluar la toxicidad de poliglutaminas (polyQ)-expansión proteínas en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Estos protocolos pueden ser fácilmente modificado para controlar la toxicidad de otras proteínas plegadas incorrectamente en la levadura.
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Artículo de método
Los ensayos de crecimiento para evaluar la toxicidad de poliglutaminas en la levadura
En este artículo
Resumen
Resumen
Mal plegamiento de proteínas se asocia con muchas enfermedades humanas, especialmente enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington 1. La enfermedad de Huntington (HD) es causada por la expansión anormal de una poliglutaminas (polyQ) región dentro de la huntingtina proteína. La proteína huntingtina polyQ expandido alcanza una conformación aberrante (es decir, misfolds) y causa la toxicidad celular 2. Al menos ocho enfermedades neurodegenerativas adicionales son causados por las expansiones polyQ, incluyendo la espinocerebelosa Ataxias y la enfermedad de Kennedy 3.
El organismo modelo la levadura ha facilitado una mejor aproximación a las bases celulares y moleculares de polyQ toxicidad, incluyendo el impacto de los factores intra-e inter-molecular de polyQ toxicidad, y la identificación de las vías celulares que se dañan en las células que expresan polyQ expansión proteínas 3-8. Importantemente, muchos aspectos de la polyQ de toxicidad que se encuentran en la levadura se reproduce en otros sistemas experimentales y en cierta medida en las muestras de los pacientes en HD, lo que demuestra la importancia del modelo de levadura para el descubrimiento de los mecanismos básicos que sustentan polyQ toxicidad.
Una forma directa y relativamente simple para determinar polyQ de toxicidad en la levadura es la medición de los defectos de crecimiento de las células de levadura que expresan las proteínas polyQ expansión. Este manuscrito describe tres enfoques complementarios experimentales para determinar polyQ-toxicidad en la levadura mediante la medición del crecimiento de células de levadura que expresan expansión polyQ-proteínas. Los dos primeros métodos experimentales monitorear el crecimiento de levaduras en las placas, el tercer enfoque monitorea el crecimiento de cultivos de levaduras líquidas utilizando el instrumento BioscreenC.
Por otra parte, este manuscrito se describen las dificultades experimentales que pueden ocurrir cuando el manejo de los modelos de levadura polyQ y describe las estrategias que ayuden a evitar ominimizar estas dificultades. Los protocolos descritos aquí se pueden utilizar para identificar y caracterizar vías genéticas y pequeñas moléculas que modulan polyQ-toxicidad. Por otra parte, los ensayos descritos pueden servir de modelo para análisis precisos de la toxicidad causada por otras enfermedades asociadas a proteínas mal plegadas en los modelos de la levadura.
Protocolo
1. Expresión de Tóxicos de expansión polyQ-proteínas en la levadura
Un análisis sistemático ha establecido la secuencia precisa de aminoácidos de una proteína polyQ-expansión que se requiere para producir toxicidad en la levadura 7. Este tóxico polyQ-expansión proteína contiene un amino-terminal-FLAG etiqueta seguido por 17 aminoácidos de la secuencia original de la proteína huntingtina, una región polyQ, y una fusión carboxi-terminal a una proteína fluorescente (GFP o bien PPC, véase la Figura 1 a). La expresión de las proteínas con las expansiones polyQ de 46 glutaminas o más (por ejemplo, 72 y 103 glutaminas) produce toxicidad....
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Discusión
Este manuscrito describe tres enfoques complementarios experimentales destinados a medir polyQ de toxicidad en el organismo modelo la levadura sobre la base de la reducción del crecimiento de células de levadura que expresan tóxicos de expansión polyQ proteínas. Trabajo en la levadura se ofreció reflexiones profundas sobre los mecanismos celulares y moleculares básicos de mal plegamiento de proteínas y su toxicidad resultante, incluyendo el mal plegamiento y la toxicidad de las proteínas de expansión polyQ-9,11,12........
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Trabajo en el laboratorio se Duennwald apoyado por becas de la Federación Americana para la Investigación del Envejecimiento (AFAR), la Fundación de Enfermedades Hereditarias (HDF) y la Fundación William Wood.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del instrumento | Empresa | Número de catálogo | |
| Frogger (6x8 pines) | V & P Científica, en San Diego | VP 407 AH | |
| BioscreenC | Growthcurves EE.UU. | 5101370 | |
| 100 y placas alveolares | Growthcurves EE.UU. | 9602550 |
Referencias
- Soto, C., Estrada, L. D. Protein misfolding and neurodegeneration. Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).
- Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).
- Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. <....
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Reimpresiones y permisos
