γ-herpesvirus (γ-VS) establecer la persistencia de toda la vida en su huésped. La infección de ratones con γ-HV68 ofrece un manejable de forma genética En vivo Modelo para la caracterización del ciclo de vida / patogenia de γHVs. Este protocolo describe la detección y cuantificación de γHV68 infección en las fases aguda y después de la infección latente por la placa de formación, centro de infecciosos, y los ensayos de PCR cuantitativa.
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Artículo de método
La medición de γHV68 infección en los ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
γ-herpesvirus (γ-VS) se caracterizan por su capacidad para establecer infecciones latentes de las células linfoides 1. El rango de hospedadores de los derechos humanos γ-VS, como EBV y HVSK, ha obstaculizado seriamente los estudios detallados patógenos. Murinas herpesvirus γ-68 (γHV68) acciones amplias similitudes genéticas y biológicas con humanos γ-VS y es un patógeno natural de los roedores múridos 2. Como tal, la evaluación de γHV68 infección de ratones puras cepas en diferentes etapas de la infección viral constituye un modelo importante para la comprensión del ciclo de vida viral y patogenia en γ-VS infección.
Tras la inoculación intranasal, γHV68 infección da lugar a una viremia aguda en el pulmón que luego resuelve en una infección latente de esplenocitos y otras células, que puede ser reactivado durante la vida del huésped 3,4. En este protocolo, se describe cómo utilizar la placa de ensayo para evaluartítulo de s virus infeccioso en el pulmón homogeneizado en monocapas de células Vero en la primera etapa (5-7 días) después de la infección intranasal (dpi). Mientras que la infección aguda es en gran parte aclaró 2-3 postinfección semana, una infección latente de γHV68 se establece alrededor de 14 dpi y mantenido posteriormente en el bazo de los ratones. La infección latente por lo general afecta a una población muy pequeña de células en los tejidos infectados, por el cual el virus permanece latente y se apaga la mayor parte de su expresión génica. Esplenocitos latente infectadas por el virus de reactivar de manera espontánea en explante en cultivo de tejidos, que puede ser recapitulado en un centro de infecciosos (IC) de ensayo para determinar la carga viral latente. A fin de estimar la cantidad de copias del genoma viral en la forma aguda y / o tejidos con infección latente, la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se utiliza para su máxima sensibilidad y precisión. El análisis combinado de los resultados de ensayo qPCR y la placa, y / o ensayo de IC se muestran los perfiles de espacio-temporal de los virusla replicación y la infectividad in vivo.
Protocolo
El siguiente protocolo se describe el estudio de los títulos de virus y la carga viral del genoma en el ciclo de infección lítica y latente de γHV68 en ratones, lo que teóricamente se puede utilizar para evaluar la infección por virus que comparten el estilo de vida similar a la de γHV68.
1. La amplificación de γHV68
- Descongelar un vial congelado de γHV68 de 37 ° C baño de agua.
- Añadir inóculo viral NIH3T12 o cultivo de células 3T3 (~ 50% de confluencia) en platos de 10 cm y la cultura de las células infectadas a 37 ° C en 5% de CO 2.
- Examinar la cultura mediante microscopía de efecto citopático (....
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Discusión
γHV68 ha sido ampliamente utilizada como modelo para entender la patogénesis de los derechos humanos γ-VS 2,4,5. En este protocolo, se describen tres métodos de rutina utilizados, incluyendo la placa de ensayo para el título de virus infecciosos, ensayo de IC de la carga viral latente, y qPCR para la carga del genoma viral, para evaluar la infección aguda y latente de γHV68 después de la inoculación intranasal en ratones.
La placa de ensayo se ha utilizado ampliamente para determi.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer el apoyo y asesoramiento técnico de Ren Sol (Universidad de California, Los Angeles) y Seungmin Hwang (Universidad de Washington). Este trabajo fue financiado por la Fundación Baxter, los Institutos Nacionales de Salud subvenciones (R01 y R21 CA140964 AI083841 a C. Liang).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del Material | Procedimiento de preparación | ||
| Metilcelulosa (MC) superposición medio de ensayo de placa viral |
| ||
| Fix / mancha por medio de la placa de ensayo | 0,2% (w / v) de cristal violeta en etanol al 20%. | ||
| Tampón de lisis ACK | NH 4 Cl 0,15 M, KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mM | ||
| DMEM completo | Dulbecco modificado de Eagle(DMEM) suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS, Invitrogen), 2 mM L-glutamina, y el 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco-BRL). |
Tabla 1. Específicas de medios utilizados en este protocolo
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo |
|---|---|---|
| La ketamina | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xilazina | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Metilcelulosa | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Tecnologías de la Vida | 11935 |
| Células colador | BD Faclon | 352340 |
| Omni homogeneizador de tejidos | OMNI Internacional | TH115 |
| Sangre y DNeasy Tissue Kit | Qiageneración | 69504 |
| IQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 PCR en tiempo real del sistema | Bio-Rad | 184-5072 |
| Contador de células | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Tabla 2. Reactivos y equipos específicos
Referencias
- Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
- Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
- Flano, ....
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Reimpresiones y permisos
