Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

Resumen

Hemos desarrollado una técnica para probar interacciones proteína-proteína en las plantas. Una proteína amarilla fluorescente (YFP) se divide en dos fragmentos que no se superponen. Cada fragmento se clona en el marco de un gen de interés a través del sistema de puerta de enlace, lo que permite la expresión de proteínas de fusión. La reconstitución de la señal de YFP sólo ocurre cuando las proteínas interactúan investigación.

Resumen

Hemos desarrollado una técnica BiFC para probar la interacción entre dos proteínas in vivo. Esto se logra mediante la división de una proteína amarilla fluorescente (YFP) en dos fragmentos que no se superponen. Cada fragmento se clona en el marco de un gen de interés. Estas construcciones se pueden co-transformado en Nicotiana benthamiana a través de la transformación mediada por Agrobacterium, permitiendo la expresión de tránsito de las proteínas de fusión. La reconstitución de la señal de YFP sólo ocurre cuando las proteínas interactúan investigación ^1-7. Para probar y validar las interacciones proteína-proteína, BiFC se puede utilizar junto con la levadura de dos híbridos (Y2H) ensayo. Esto puede detectar interacciones directas e indirectas que se puede contemplar en el Y2H. La tecnología Gateway es una plataforma universal que permite a los investigadores para llevar a los genes de interés (GOI) como la expresión en muchos sistemas de análisis funcional como sea posible ^8,9. Tanto la orientación y el marco de lectura se puede mantener sin el uso de enzimas de restricción o la ligadura de expresión para hacer listas para clones. Como resultado, se pueden eliminar todos los pasos de la secuencia de nuevo para asegurar resultados consistentes a lo largo de los experimentos. Hemos creado una serie de vectores Gateway compatible BiFC y Y2H que proporcionar a los investigadores y fácil de utilizar herramientas para llevar a cabo ensayos tanto BiFC y Y2H ^10. Aquí se demuestra la facilidad de uso de nuestro sistema BiFC para probar interacciones proteína-proteína en N. benthamiana plantas.

Protocolo

1. Preparación de cultivo de Agrobacterium

1. Cepa de Agrobacterium GV3101 previamente transformada con Gateway compatible BiFC vector pEarleyGate201-YC y pEarleyGate202 YN-, cada uno con una construcción de fusión de Gobierno de la India.
2. Inocular un 5 ml YEB (5 g L ^-1 extracto de carne, 1 g L ^-1 extracto de levadura, 5 g L ^-1 de peptona, 5 g L ^-1 de sacarosa, 2 mM MgSO _4, pH 7,2) la cultura de la proteína de fusión BiFC construye Agrobacterium transformado con el selección del antibiótico adecuado. Cultive hasta el día en 28 ° C con agitación a 200 rpm.
3. Retire 1 ml de la cultura en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml.
4. Precipitar las células a 1.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante.
5. Lavar el sedimento mediante la adición de 1 ml de los medios de infiltración (5 g ^L-1 D-glucosa, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na ₃ PO _4, 0,1 mM acetosiringona) ^11. Resuspender pellet con la pipeta, las células de pellets de nuevo a 1.000 g durante 10 minutos.
6. Repita el paso de lavado dos veces más.
7. Resuspender el precipitado en 0,5 ml de medio de infiltración.
8. Medir la absorbancia a 600 nm y ajustar el final de OD ₆₀₀ a 1,0 a 1,2.
9. Alícuota de una cantidad igual de suspensión de Agrobacterium de cada construcción en un tubo de 1.5 ml nuevo, vortex durante 10 segundos. Para una sola infiltración, 100 L de cada construcción es más que suficiente.
10. La mezcla de Agrobacterium está listo para la infiltración.

2. Infiltración

11. Plantas de N. benthamiana se cultivan a 21 ° C, con 16 horas de luz y 8 h oscuridad ciclos. Cinco de las plantas de seis semanas de edad, se debe utilizar para la infiltración.
12. Retire las plantas de la sala de crecimiento y de lugar en la luz blanca durante 1 h antes infiltratring que permite que los estomas se abra completamente.
13. Elaboración de mezcla Agrobacterium resuspendió en un 1 ml de deslizamiento punta de la jeringa de tuberculina sin aguja.
14. Coloque la punta de la jeringa contra la parte inferior de la hoja y suavemente el émbolo, mientras que apoyan directamente la parte superior de la hoja con un dedo. El líquido se difunden a través de la hoja, ya que llena los espacios de aire mesophyllar.
15. Etiqueta de la zona infiltrada con un marcador para la identificación futura.
16. Cuando la infiltración con diferentes construcciones, asegúrese de que cambie sus guantes o limpiar con etanol al 70% entre las infiltraciones. Si es posible, deje un espacio nervio central entre las diferentes muestras para evitar la contaminación cruzada.
17. Colocar las plantas en un armario de crecimiento bajo condiciones normales de crecimiento.

3. Observación de la señal de YFP reconstituido

18. Al consumo de un segmento 5mm x 5mm de tejido de las hojas dentro de la zona infiltrada
19. Montaje de la muestra, en el agua, en un portaobjetos de vidrio, cubrir la muestra con un cubreobjeto y examinar las interacciones con un microscopio confocal o de fluorescencia.
20. Expresión deben ser controlados cada 24 horas desde el momento de la infiltración de hasta 5 días después de la sobre-expresión / la trata puede dar lugar a proteínas de fusión fluorescentes mostrando diferentes lugares durante un transcurso de tiempo.

4. Los resultados representativos:

Un ejemplo de interacción proteína-proteína a prueba mediante un ensayo BiFC se muestra en la Figura 1. AtTHP1 AtSAC3A y se cree que son los componentes de la Arabidopsis homólogo de la levadura-2 TREX complejo. Pueden interactuar con un AtNUP1 nuclearporin y facilitar la exportación del ARNm ^10. AtTHP1 y AtSAC3A fueron clonados en pEarlyGate201-YC mientras AtNUP1 fue clonado en pEarlyGate202-SN. Las construcciones se transformaron posteriormente en GV3101. Las tres construcciones fueron emparejados con tres combinaciones posibles (AtTHP1 + AtNUP1; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 AtSAC3A +) para la infiltración. La reconstitución de la señal YFP se observó bajo un LCSM 48 horas después de la infiltración. Las señales se han observado en las células epidérmicas y localizadas en la periferia nuclear o plasma nuclear, lo cual es consistente con la localización subcelular de estas proteínas. Los controles negativos no mostraron ninguna señal de YFP.

Figura 1. Arabidopsis TREX-2 componentes de exportación de ARNm complejo interactúan unos con otros. N. benthamiana hojas, co-transformadas con construcciones de Gobierno de la India fusionado a pEarleyGate201-YC y pEarleyGate202-SN (como se indica), se obtuvieron imágenes de 48 a 72 h después de la infiltración, utilizando un microscopio Leica TCS SP2 confocol. Las imágenes se muestran como YFP fusión confocal y brillantes imágenes de campo de la epidermis N. benthamiana hoja de células

Discusión

BiFC ensayo es una herramienta poderosa para el estudio de las interacciones proteína. A diferencia de la tradicional prueba de Y2H, BiFC no sólo permite la visualización de las interacciones proteína-proteína, sino que también proporciona más información sobre el complejo de proteínas, tales como localización subcelular. Además, es posible detectar interacciones directas e indirectas, siempre y cuando las dos proteínas candidatas pueden acercarse lo suficiente por un tercer socio. Como cualquier tecnología, BiFC tiene ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetosiringa	Sigma-Aldrich	D134406
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M2933
1 mL jeringa de tuberculina con punta deslizante	BD Biosciences	309602