Este protocolo ilustra una técnica de recolección de coccígea discos intervertebrales de la especie bovina para el cultivo de órganos para In vitro La cultura de órganos.
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Artículo de método
Preparación de la cola intacta discos intervertebrales bovina para la Cultura de Órganos
En este artículo
Resumen
Resumen
El disco intervertebral (DIV) es la articulación de la columna vértebra a vértebra conexión. Su función es transmitir la carga de la columna y dar flexibilidad a la columna vertebral. Se compone de tres compartimentos: el núcleo pulposo interior (NP), que abarca el anillo fibroso (AF), y dos placas de extremo cartilaginoso conecta el PN y el FA en el cuerpo vertebral en ambos lados. El dolor discogénico, posiblemente causado por una enfermedad degenerativa del disco intervertebral (DDD) y hernias de disco ha sido identificado como un problema importante en nuestra sociedad moderna. Para estudiar los posibles mecanismos de la degeneración IVD, en los sistemas de cultivo in vitro con células de órganos disco en vivo son muy atractivas. El cultivo in vitro de la especie bovina intacta DIV coccígea ha avanzado a un sistema de modelo correspondiente, que permite el estudio de la mecano-biológicos aspectos en un ambiente bien controlado fisiológicos y mecánicos. DIV bovina cola se puede obtener con relativa facilidad en un mayor númerod son muy similares a los humanos DIV lumbar con respecto a la densidad celular, la población de células y las dimensiones. Sin embargo, las técnicas anteriores bovina caudal cosecha IVD retener platillos cartilaginosos y óseos platillos no después de 1-2 días de cultivo ya que las vías fueron bloqueadas, obviamente, la nutrición por la sangre coagulada. DIV son los principales órganos avascular, por lo tanto, los nutrientes a las células en el PN sólo dependen de la difusión a través de las papilas capilares del cuerpo vertebral adyacente. Presencia de restos de huesos y la sangre coagulada en la superficie de la placa terminal puede impedir la difusión de nutrientes en el centro del disco y la viabilidad celular compromiso. Nuestro grupo ha establecido un protocolo relativamente rápida de "crack", el DIV de la cola con un bajo riesgo de contaminación. Somos capaces de permeabilizar las superficies óseas recién cortada placa terminal mediante un sistema de chorro de lavado quirúrgico, que elimina los coágulos de sangre y restos de corte y de manera muy eficiente se vuelve a abrir la vía de difusión de nutriciónen el centro de la DIV. La presencia de placas de crecimiento en ambos lados del hueso vertebral tiene que ser evitada y para ser removido antes de la cultura. En este vídeo, se exponen los pasos cruciales en la preparación y demostrar la clave para una cultura de órganos con éxito el mantenimiento de la viabilidad celular alta durante 14 días en cultivo sin inflamación. El tiempo de cultivo podría extenderse al entorno mecánico adecuado se puede mantener mediante el uso de biorreactores de carga mecánica. La técnica ha demostrado aquí se puede extender a otras especies animales, como porcinos, ovinos y aislamiento leporino IVD caudal y lumbar.
Protocolo
1. La cosecha del disco intervertebral
- La cola toda la longitud de la especie bovina se obtiene de un matadero local, si es posible sin la piel ya que la presencia de la piel aumenta la probabilidad de contaminación (Fig. 2).
- Prepare la tabla de cortar grande y preparar la estación de trabajo e instrumentos estériles en la parte superior de una tabla de cortar (Fig. 2).
- Preparar bajo la capucha de gasa estéril laminar flujo estéril humedecida con cloruro sódico al 0,9% que contiene citrato de sodio de 55 mm y poner en cada pocillo de la placa de 6 pocillos.
- Prepare un recipiente y se diluye 1:100 solución de Betadine con agua ....
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Discusión
El primer paso para el cultivo de órganos con éxito es asegurarse de que el explante no debe estar contaminada. La cola debe ser de piel antes de comenzar con el procedimiento. Cualquier pelo llevados a un laboratorio estéril podría ser problemático en términos de contaminación. La cola de la especie bovina idealmente deben estar tan frescos como sea posible (esto afecta a la viabilidad inicial de la célula). Además, el paso de lavado betadine se recomienda para reducir el riesgo de contaminación. En lugar de utilizar u.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Este proyecto fue financiado por la Swiss National Science Foundation (SNF # 310030-127586/1).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| De tejido fresco de bovino disco intervertebral de las colas de las especies bovina, de la casa de masacre local (idealmente dentro de las horas post-mortem y sin piel). | |||
| Pulsavac Plus System CA | Zimmer inc., Suiza | 00-5150-486-01 | El mejor rendimiento con el jefe de la cadera en aerosol y con fuente de alimentación de corriente alterna (la que tiene el paquete de 8 pilas AA también funciona, pero es menos conveniente) |
| Alta capacidad del ventilador spray w / Protector contra salpicaduras, longitud 12,7 cm | Zimmer inc., Suiza | 00-5150-175-00 | Hay varias cabezas de aerosol disponibles, hemos probado con éxito este |
| Hojas de bisturí # 22 y # 10 | Swann-Morten, Inglaterra | # 10: 0201 # 22: 0208 | |
| Titular de la hoja de bisturí # 3 y # 4 | Hausmann, Alemania | # 3: 06.103.00 # 4: 06.104.00 | |
| Lutz industrial blade | Lutz, Alemania | 1022.0884 | |
| Tampón fosfato salino (PBS) | Invitrogen, Suiza | 10010-023 | |
| Dulbecco Eagle modificado (DMEM) | Gibco, Suiza | 11960-044 | |
| Solución de Ringer lactato (sin glucosa) | Bichsel, Suiza | 133 0002 | |
| 6-y multi-pocillos | TPP, Suiza | 92006 | |
| Betadine solución | Mundipharma, Suiza | 10055025 | |
| Marcador quirúrgica de la piel | Porex Surgical, Suiza | 9560 | |
| Tabla de cortar grande | Cualquier marca es posible |
Referencias
- Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).
- Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D.
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Reimpresiones y permisos
Etiquetas
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