La medición de flujos rápidos de calcio en los cardiomiocitos

Resumen

Se presenta un método para aislar rápida (microsegundos) eventos de calcio de los flujos más lentos en las células vivas mediante microscopía confocal de barrido láser. El método mide las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia de los indicadores de calcio por los escáneres de la línea de la grabación de varios cientos de píxeles en una celda. Análisis del histograma nos permite aislar las escalas de tiempo de los flujos de calcio diferentes.

Resumen

Cardiomiocitos tienen múltiples flujos de Ca ^{2 +} de duración variable que trabajan en conjunto para optimizar la función de ^1,2. Los cambios en Ca ^{2 +} actividad en respuesta a los agentes extracelular generalmente regulado por la fosfolipasa Cβ-Gα vía _q localizada en la membrana plasmática que es estimulada por agentes tales como la acetilcolina ^3,4. Recientemente, hemos encontrado que el plasma dominios de la proteína de membrana llamada caveolas ^5,6 activado puede atrapar Gα _q ^7. Esta trampa tiene el efecto de la estabilización del estado de activación de _q Gα y prolongado resulta en Ca ^{2 +} en cardiomiocitos señales y otros tipos de células ^8. Hemos descubierto el sorprendente resultado de la medición de las respuestas dinámicas de calcio en una escala rápida en los cardiomiocitos de vida. Brevemente, las células se cargan con un fluorescente de Ca ^{2 +} indicador. En nuestros estudios, hemos utilizado Ca ^{2 +} Verde (Invitrogen, enc.) que exhibe un aumento en la intensidad de emisión de fluorescencia tras la unión de los iones de calcio. La intensidad de la fluorescencia se registra para utilizar un modo de línea de exploración de un microscopio confocal de barrido láser. Este método permite la adquisición rápida de la evolución temporal de la intensidad de la fluorescencia en píxeles a lo largo de una línea seleccionada, la producción de varios cientos de huellas de tiempo en la escala de tiempo de microsegundos. Estas huellas muy rápido se transfieren a Excel y luego en Sigmaplot para el análisis, y se comparan con las huellas obtenidas por el ruido electrónico, colorante libre, y otros controles. Para analizar las respuestas de Ca ^{2 +} de diferentes tasas de flujo, se realizó un análisis histograma que binned intensidades de los píxeles con el tiempo. Hurgar en la basura que nos permite agrupar a más de 500 huellas de los análisis y visualización de los resultados compilados espacial y temporalmente en una única parcela. Por lo tanto, la lentitud en Ca ^{2 +} olas que son difíciles de discernir cuando los análisis se superponen debido a la colocación de diferentes picos y ruido, puede ser visto fácilmente enlos histogramas agrupada. Flujos muy rápidos en la escala de tiempo de la medición muestran una estrecha distribución de intensidades en los contenedores de muy poco tiempo, mientras que más de Ca ^{2 +} ondas de mostrar los datos agrupada con una amplia distribución en contenedores de tiempo más largo. Estas distribuciones horarias diferentes nos permiten analizar el tiempo de los flujos de Ca ^{2 +} en las células, y para determinar su impacto en diversos procesos celulares.

Protocolo

1. Las células de carga con los indicadores de calcio

1. Células de la placa de 35 mm con fondo de cristal platos MatTek (o cualquier otro fondo de cristal, ver cámaras).
2. Si se usa capa miocitos primarios de las cámaras un día antes con 10μg/ml laminina. Placa cardiaca miocitos (aislado de los perros adultos, ratas recién nacidas, u otro organismo), en KB buffer (K-inversión de tampón de Tyrode 35 mmol / L de HEPES, 140 mmol / L de KCl, 8 mmol / L de _KHCO3, 2 mmol / L de MgCl ₂ y 0,4 mmol / L de KH ₂ PO _4, pH 7,5) y el cambio poco a poco a la M199 suplementado con suero fetal bovino 15% y el 1% y el 0,5% s....

Discusión

Hemos desarrollado un método para ver y aislar las señales rápidas de calcio en los cardiomiocitos de vida. Si bien las condiciones experimentales de estas mediciones han sido previamente aplicada a otros sistemas celulares ^10, así como los cardiomiocitos ^11, el uso de histogramas y análisis bin permite que los datos de muchos de Ca ^{2 +} eventos a ser adquiridos. Más rápido los acontecimientos pueden ser fácilmente aislados de los más lentos y modelos adaptados a comprender sus mecanismos.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	Invitrogen	ABCD1234