Visualización de Ca Vascular 2 + Señalización desencadenada por paracrina derivados ROS

Resumen

Un método eficaz para obtener información sobre la visualización de la inducción paracrina derivados de ROS endotelial Ca2 + de señalización se describe. Este método tiene la ventaja de medir paracrina derivados ROS provocó la movilización de Ca2 + en las células endoteliales vasculares en un modelo de co-cultivo.

Resumen

El estrés oxidativo ha sido implicado en una serie de condiciones patológicas incluyendo el daño por isquemia / reperfusión y la sepsis. El concepto de estrés oxidativo se refiere a la formación aberrante de los ROS (especies reactivas de oxígeno), que incluye O ₂ ^{• -,} H ₂ O _2, y los radicales hidroxilo. Especies reactivas de oxígeno influye en multitud de procesos celulares, como la transducción de señales, la proliferación celular y muerte celular ^1-6. ROS tienen el potencial de daño vascular y las células de órganos directamente, y puede iniciar reacciones químicas secundarias y las alteraciones genéticas que en última instancia, dar lugar a una amplificación de la lesión tisular mediada por ROS inicial. Un componente clave de la cascada de amplificación que agrava el daño irreversible del tejido es el reclutamiento y activación de células inflamatorias circulantes. Durante la inflamación, las células inflamatorias producen citoquinas tales como factor de necrosis tumoral α (TNF) y que la IL-1activan las células endoteliales (CE) y las células epiteliales y además aumentar la respuesta inflamatoria ^7. La disfunción del endotelio vascular es una característica establecida de la inflamación aguda. Macrófagos contribuyen a la disfunción endotelial durante la inflamación por mecanismos que no están claros. La activación de los resultados de los macrófagos en la liberación extracelular de O ₂ ^{• -} y varias citoquinas pro-inflamatorias, lo que desencadena la señalización patológica de las células adyacentes ^8. NADPH oxidasas son la fuente principal y primordial de ROS en la mayoría de los tipos de células. Recientemente, se muestra por nosotros y otros ^9,10 que ROS producido por NADPH oxidasas inducir la producción mitocondrial de ROS durante muchas condiciones fisiopatológicas. Por lo tanto la medición de la producción mitocondrial de ROS es igual de importante, además de medir citosólica ROS. Los macrófagos producen ROS por la NADPH oxidasa flavoproteína enzima que juega un papel primordial en la inflamación. Una vez activado,NADPH oxidasa fagocítica produce grandes cantidades de O ₂ ^{• -} que son importantes en el mecanismo de defensa del huésped ^11,12. Aunque paracrina derivados de O ₂ ^{• -} juega un papel importante en la patogénesis de las enfermedades vasculares, la visualización de paracrinos ROS inducida por la señalización intracelular, incluyendo la movilización de Ca ^{2 +} sigue siendo hipótesis. Hemos desarrollado un modelo en el que los macrófagos activados se utilizan como fuente de O ₂ ^{• -} la transducción de una señal a las células endoteliales adyacentes. El uso de este modelo se demuestra que los macrófagos derivados de O ₂ ^{• -} llevar a la señalización del calcio en las células endoteliales adyacentes.

Protocolo

Especies reactivas de oxígeno se puede medir en células vivas con tintes sensibles a la oxidación (1 y 2) o el uso de sensores de plásmido (3 y 4) por microscopía confocal.

1. Visualización de citosólica de ROS en células J774

1. Crecer J774.1 ratón macrófagos derivados de monocitos (10 ⁶ células / ml) en el fondo de cristal de 35 mm platos (Harvard Apparatus) durante 48 h.
2. Células desafío con agonistas TLR (2 ug / ml, Lipo-teicoicos ácido TLR2 agonista; 10μg/ml, poli (I: C)-agonista TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4 agonistas) durante 6 horas a 37 ° C.
   Nota: Los macrófagos tratados en condiciones similares se uti....

Discusión

El método aquí descrito permite una medición rápida y cuantitativa de las especies reactivas del oxígeno en las células vivas, ya sea usando tintes sensibles a la oxidación o los sensores de plásmido. Los agonistas de los TLR (Toll-like receptors) son compuestos que estimulan a las células a través de los TLR en la superficie celular y la activación de las vías de señalización hacia abajo ^15. En nuestro protocolo, se utilizaron tres diferentes TLR es decir agonistas, Lipo-teicoicos ácido TLR2 agonista; poli (.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo	Empresa	Número de catálogo
Attofluor cámara de celular	Invitrogen	A7816
Antimicina	Sigma Aldrich	A8674
Medio DMEM glucosa baja	Invitrogen	10567-014
De crecimiento del endotelio suplemento factor (ECG)	Al norte del estado	02-102
El suero fetal bovino	Invitrogen	12662011
G418	Invitrogen	10131-027
Gelatina	Sigma Aldrich	G1393
H 2 DCFDA	Invitrogen	D-399
LPS	Sigma Aldrich	L4516
LTA	Sigma Aldrich	L2515
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008
Opti-MEM I Reducción media en suero	Invitrogen	51985091
Penicilina / estreptomicina (10 veces)	Invitrogen	15140163
pHyPer-cito	Evrogen	FP941
pHyPer-dMito	Evrogen	FP942
Poli (I: C)	Sigma Aldrich	P0913
Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.
SigmaPlot 11,0	Systat Software, Inc.
Tripsina-EDTA (10 veces)	Invitrogen	15400054
T-25 Frascos	Corning	430639
T-75 Frascos	BD Falcon	353136
96 y TC micro y placa	BD Falcon	353072
Zen software 2009	Carl Zeiss 510 Meta microscopía confocal