En este protocolo un método para medir el replegamiento de proteínas intracelulares tras el choque térmico se describe. Este método puede ser usado para estudiar foldases como chaperones moleculares y sus co-factores o componentes capaces de influir en su actividad. La actividad luciferasa de luciérnaga se utiliza como reportero para medir la actividad de las chaperonas replegado.
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Artículo de método
Ensayo Replegado intracelular
En este artículo
Resumen
Resumen
Este protocolo describe un método para medir la actividad enzimática de las chaperonas moleculares en un sistema basado en células y los posibles efectos de los compuestos con actividad inhibitoria / estimulante. Chaperonas moleculares son proteínas implicadas en la regulación de un plegamiento de proteínas y tienen un papel crucial en la promoción de la supervivencia celular al estrés, como los insultos de choque térmico 2, el hambre de nutrientes y la exposición a productos químicos / venenos 3. Por esta razón, los acompañantes se encuentran para participar en eventos como el desarrollo de tumores, chemioresistance de 4 células de cáncer, así como la neurodegeneración 5. El diseño de pequeñas moléculas capaces de inhibir o estimular la actividad de estas enzimas es por lo tanto, una de las estrategias más estudiadas para el tratamiento del cáncer y enfermedades neurodegenerativas 7 9. El ensayo aquí descrito ofrece la posibilidad de medir la actividad de replegamiento de una chaperona molecular en particular y para estudiar el efecto de un borradorHeridas en su actividad. En este método el gen de la chaperona molecular se investiga transfectadas con un vector de codificación de expresión para el gen de la luciferasa de luciérnaga. Ya se ha descrito que desnaturalizan luciferasa de luciérnaga puede ser replegada por chaperonas moleculares 10,11. Como la normalización de control de transfección, un vector de codificación para el gen de la luciferasa Renilla es transfectadas. Todas las transfecciones se describe en este protocolo se realizan con X-treme Gene 11 (Roche) en células HEK-293. En el primer paso, la síntesis de proteínas es inhibida por el tratamiento de las células con cicloheximida. A partir de entonces se desarrolla la proteína inducida por choque térmico a 45 ° C durante 30 minutos. Sobre la recuperación a 37 ° C, las proteínas son re-doblado en su conformación activa y la actividad de la luciferasa de luciérnaga se utiliza como lectura: la luz se producirá más, la proteína más tendrá recuperó la conformación original. No-calor células sorprendido se establecen como referencia (100% de replegarseluciferasa).
Protocolo
1. Sembrar las células
- Antes de empezar, calentar el medio de cultivo, el PBS 1X y tripsina en un baño de agua a 37 ˚ C
- Tomar las células de la incubadora y se aspira el medio.
- Aplique suavemente 5 ml de PBS 1X en las células para lavarlos.
- Aspirar el PBS 1X y aplicar 1 ml de tripsina que contiene 0,025% de EDTA.
- Gire suavemente la placa para tener una distribución uniforme de la tripsina.
- Coloque las células de la incubadora a 37 ˚ C durante 5-10 minutos (dependiendo del tipo de célula). De vez en vez, compruebe si las células están separadas por agitación de la placa.
- Resuspender las células en ....
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Discusión
En este trabajo un protocolo para medir la actividad intracelular de replegado de las chaperonas moleculares se presenta. Todo el ensayo se puede realizar en 3 ó 4 días como lo demuestra la visión de la figura. 1.
La robustez y la linealidad de la señal de luz producida por la luciérnaga y la luciferasa Renilla representan una base sólida para la reproducibilidad del protocolo.
El paso crítico de la prueba es la elección de un reactivo de transfe.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Danilo Maddalo es un beneficiario de una beca de investigación como el Grupo de Jóvenes Investigadores (YIG) del Instituto de Tecnología de Karlsruhe.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
Para este experimento "Luz Vector 'una forma luminómetro Perkin Elmer '1420 contador de luminiscencia se utilizó
Programas para el luminómetro:
Renilla: la bomba 1, 100 l de inyección
Tampón de reacción: Pump1, inyectar 70 l
Luciferina: Pump2, inyección 30μl
Para los buffers de preparar estas soluciones madre con agua destilada:
- - 1M MgSO 4: 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O en 1 litro
- - 0,5 M EGTA: 190,18 g EGTA en 1 litro
- - 1M KH 2 PO 4: 136,09 g KH 2 PO 4 en 1 litro
- - 1M K2 HPO 4: 228,23 g K 2 HPO 4 * 3 H 2 O en 1 litro
- - 5 M NaCl: 292,2 g de NaCl en 1 litro
- - 0,5 M EDTA: 186,12 g EDTA * 2H 2 O en 1 litro
Gly-Gly-buffer:
- - 25mm Glycylglycin
- - 15 mM MgSO 4
- - 4 mm EGTA
Para un uso litro a 3,3 g de Glycylglycin, 15 ml de una solución 1M MgSO4 y 8 ml de una solución 0,5 M EGTA. Resolver en el agua, ajustar el pH a 7,8 y llevar a un volumen total de 1 litro.
Tampón de reacción para Renilla / Coelenterazine búfer:
- - & Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4
- - 86,6 mM KH 2 PO 4
- - 0,5 M NaCl
- - 1 mM EDTA
Para un uso litros 13,4 ml de 1M KH 2 PO 4 solución, 86,6 ml de 1M K 2 HPO 4 solución, 100 ml de una solución de NaCl 5M y 2 ml de una solución 0,5 M EDTA.
| Empresa | Catálogo / Número de producto: | |
| DMEM (Dulbecco modificado de Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 |
| Oro suero bovino fetal | PAA | A15-151 |
| Gene X-treme 9 ADN reactivo de transfección | Roche | 06365809001 |
| PBS Fosfato de Dulbecco solución salina tamponada 1X | GIBCO | 14190-094 |
| MOPS 3 - (N-morfolino) propanosulfónico | SIGMA-ALDRICH | M1254 |
| Cicloheximida | SIGMA-ALDRICH | C7698 |
| Tampón de lisis pasiva 5X | Promega | E194A |
Glycylglycin | SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 |
KH 2 PO 4 | Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 |
| Luciferina Firefly | Biosynth | L8200 |
| Coelenterazine | Biosynth | C7000 |
| DTT (ditiotreitol) | Roth | 6908.2 |
| ATP (trifosfato de adenosina) | Roche | 10519987001 |
Referencias
- Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
- Ritossa, F. Discovery of the heat shock response. Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).
- Hendrick, J. P., Hartl, F. U.
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Reimpresiones y permisos
