Los protocolos para el trasplante de células germinales de testículo y el xenotrasplante de tejido se describen. Germen de los resultados de trasplante de células en donantes derivado de la espermatogénesis en los testículos receptores y representa un ensayo de reconstitución funcional para la identificación de células madre de espermatogonias (SSC). Tejido testicular xenoinjerto reproduce desarrollo de los testículos y la espermatogénesis de las especies de los distintos donantes en los ratones receptores.
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Artículo de método
Germen de Trasplante de Células y Tejidos Testículos xenotrasplante en ratones
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Resumen
Resumen
El transplante de células germinales fue desarrollado por el Dr. Ralph Brinster y sus colegas de la Universidad de Pennsylvania en 1994 1,2. Estos estudios innovadores mostraron que la microinyección de células germinales de los ratones donantes fértiles en los túbulos seminíferos de ratones infértiles receptores de donantes en los resultados derivados de la espermatogénesis y la producción de esperma por parte del animal receptor 2. El uso de machos donantes que transporten la bacteriana β-galactosidasa la identificación de genes permitido de donante-deriva la espermatogénesis y la transmisión de la haplotipo donante a la descendencia por 1 los animales receptores. Sorprendentemente, después de un trasplante en el lumen de los túbulos seminíferos, las células germinales trasplantados fueron capaces de pasar del compartimento luminal de la membrana basal, donde se encuentran las espermatogonias 3. En general se acepta que las ESC sólo son capaces de colonizar el nicho y la espermatogénesis volver a establecerse en los testículos receptores. Por lo tanto, de células germinalesel trasplante ofrece un enfoque funcional para estudiar el nicho de células madre en los testículos y caracterizar supuestas células madre de espermatogonias. Hasta la fecha, el trasplante de células germinales se utiliza para dilucidar la biología básica de células madre, para producir animales transgénicos a través de la manipulación genética de células germinales antes del trasplante 4,5, para estudiar células de Sertoli-germen de interacción celular 6,7, SSC homing y la colonización 3, 8, así como la CSE auto-renovación y diferenciación 9,10.
El trasplante de células germinales es también factible en especies de gran tamaño 11. En éstas, las principales aplicaciones son la preservación de la fertilidad, la difusión de la genética de élite en las poblaciones animales, y la generación de animales transgénicos como el estudio de la espermatogénesis y la biología de piel a piel con esta técnica es logísticamente más difícil y caro que en los roedores. El trasplante de células germinales de especies de gran tamaño en los túbulos seminíferos de ratones resulta en colonizatde iones de las células del donante y la expansión espermatogonias, pero no en su diferenciación completa presumiblemente debido a la incompatibilidad del compartimiento célula receptora somática con las células germinales de especies filogenéticamente distantes 12. Un enfoque alternativo es el trasplante de las células germinales de especies de gran tamaño, junto con su entorno compartimento somática. Estamos por primera vez en 2002, que pequeños fragmentos de tejido testicular de los machos inmaduros trasplantadas bajo la piel dorsal de ratones inmunodeficientes son capaces de sobrevivir y tener un desarrollo completo con la producción de esperma fertilización competente 13. Desde entonces, tejido testicular xenoinjerto se ha demostrado para tener éxito en muchas especies y ha surgido como una alternativa valiosa para estudiar el desarrollo testicular y la espermatogénesis de los animales grandes en ratones 14.
Protocolo
PARTE A. El transplante de células germinales en ratones
1. Preparación de los ratones receptores
- Los beneficiarios deben ser inmunológicamente tolerantes (ya sea genéticamente compatible a los donantes o inmunológico deficiente) a las células del donante de testículo.
- Los beneficiarios deben ser, naturalmente, carece de la espermatogénesis (por ejemplo, W / v ratones) o de agotamiento de las células germinales endógenos. El agotamiento de células germinales se puede lograr por irradiación o fármacos quimioterapéuticos tales como busulfano. En este protocolo, se describe el método de preparación de l....
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Discusión
1. El transplante de células germinales
Germen de trasplante de células proporciona el ensayo sólo funcional para la confirmación inequívoca de la presencia de células madre de espermatogonias (SSC) en una población celular. SSC Sólo en casa pueden y colonizar el nicho de cooperación Sur-Sur en la membrana basal e iniciar los donantes derivado de la espermatogénesis. El transplante de células germinales ha permitido estudiar y manipular las ESC de una manera sin precedentes. La técnica ha sido.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Trabajo en el laboratorio los autores ha sido apoyado por el USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213), NIH / CNRR (2 R01 RR17359-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) y Alberta Innova - Soluciones para la Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| La colagenasa (tipo IV) | Sigma | C5138 | |
| Tripsina-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053-028 | |
| Trypan mancha azul | Invitrogen | 15250-061 | |
| Malla de nylon filtro de células | BD Biosciences | 352.340 (40 micromolar) 352 350 (70μm) | |
| Busulfano | Sigma | B2635 | |
| De pared delgada capilares de vidrio | Mundial de instrumentos de precisión | TW 100-3 | |
| BD intramedic tubo plyethylene (PE100) | BD | CA-63018-725 | |
| Ethicon 6-0 sutura de seda | Ethicon | 706G | |
| Clips de la herida | BD | 427631 | |
| Sigmacote | Sigma | SL2 | |
| X-gal | Sigma | B4252 | |
| Ferrocianuro de potasio | Sigma | P9387 | |
| Ferricianuro de potasio | Sigma | P3667 | |
| cloruro de magnesio | Sigma | 208337 | |
| sodio desoxicolato | Sigma | D6750 | |
| N, N-Dimetilformamida | Sigma | D4551 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | 18896 |
Referencias
- Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11303-11303 (1994).
- Brinster, R. L., Zimmermann, J. W.
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Reimpresiones y permisos
