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Artículo de método

Germen de Trasplante de Células y Tejidos Testículos xenotrasplante en ratones

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DOI:

10.3791/3545

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6 de febrero de 2012

 ,  , 
1Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, University of Calgary

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Los protocolos para el trasplante de células germinales de testículo y el xenotrasplante de tejido se describen. Germen de los resultados de trasplante de células en donantes derivado de la espermatogénesis en los testículos receptores y representa un ensayo de reconstitución funcional para la identificación de células madre de espermatogonias (SSC). Tejido testicular xenoinjerto reproduce desarrollo de los testículos y la espermatogénesis de las especies de los distintos donantes en los ratones receptores.

Resumen

El transplante de células germinales fue desarrollado por el Dr. Ralph Brinster y sus colegas de la Universidad de Pennsylvania en 1994 1,2. Estos estudios innovadores mostraron que la microinyección de células germinales de los ratones donantes fértiles en los túbulos seminíferos de ratones infértiles receptores de donantes en los resultados derivados de la espermatogénesis y la producción de esperma por parte del animal receptor 2. El uso de machos donantes que transporten la bacteriana β-galactosidasa la identificación de genes permitido de donante-deriva la espermatogénesis y la transmisión de la haplotipo donante a la descendencia por 1 los animales receptores. Sorprendentemente, después de un trasplante en el lumen de los túbulos seminíferos, las células germinales trasplantados fueron capaces de pasar del compartimento luminal de la membrana basal, donde se encuentran las espermatogonias 3. En general se acepta que las ESC sólo son capaces de colonizar el nicho y la espermatogénesis volver a establecerse en los testículos receptores. Por lo tanto, de células germinalesel trasplante ofrece un enfoque funcional para estudiar el nicho de células madre en los testículos y caracterizar supuestas células madre de espermatogonias. Hasta la fecha, el trasplante de células germinales se utiliza para dilucidar la biología básica de células madre, para producir animales transgénicos a través de la manipulación genética de células germinales antes del trasplante 4,5, para estudiar células de Sertoli-germen de interacción celular 6,7, SSC homing y la colonización 3, 8, así como la CSE auto-renovación y diferenciación 9,10.

El trasplante de células germinales es también factible en especies de gran tamaño 11. En éstas, las principales aplicaciones son la preservación de la fertilidad, la difusión de la genética de élite en las poblaciones animales, y la generación de animales transgénicos como el estudio de la espermatogénesis y la biología de piel a piel con esta técnica es logísticamente más difícil y caro que en los roedores. El trasplante de células germinales de especies de gran tamaño en los túbulos seminíferos de ratones resulta en colonizatde iones de las células del donante y la expansión espermatogonias, pero no en su diferenciación completa presumiblemente debido a la incompatibilidad del compartimiento célula receptora somática con las células germinales de especies filogenéticamente distantes 12. Un enfoque alternativo es el trasplante de las células germinales de especies de gran tamaño, junto con su entorno compartimento somática. Estamos por primera vez en 2002, que pequeños fragmentos de tejido testicular de los machos inmaduros trasplantadas bajo la piel dorsal de ratones inmunodeficientes son capaces de sobrevivir y tener un desarrollo completo con la producción de esperma fertilización competente 13. Desde entonces, tejido testicular xenoinjerto se ha demostrado para tener éxito en muchas especies y ha surgido como una alternativa valiosa para estudiar el desarrollo testicular y la espermatogénesis de los animales grandes en ratones 14.

Protocolo

PARTE A. El transplante de células germinales en ratones

1. Preparación de los ratones receptores

  1. Los beneficiarios deben ser inmunológicamente tolerantes (ya sea genéticamente compatible a los donantes o inmunológico deficiente) a las células del donante de testículo.
  2. Los beneficiarios deben ser, naturalmente, carece de la espermatogénesis (por ejemplo, W / v ratones) o de agotamiento de las células germinales endógenos. El agotamiento de células germinales se puede lograr por irradiación o fármacos quimioterapéuticos tales como busulfano. En este protocolo, se describe el método de preparación de los ratones receptores con busulfan.
  3. Tratar a los destinatarios a 4-6 semanas de edad a través de la inyección intraperitoneal de busulfano. La dosis óptima de busulfano es dependiente de la cepa. En cepas receptoras comúnmente utilizadas, una dosis de 40-50 mg / kg es suficiente para agotar las células germinales endógenos (por ejemplo, 44 ​​mg / kg para ratones desnudos, 50 mg / kg para B6/129 destinatarios F1).
  4. Disolver busulfano polvo en DMSO y luego añadir un volumen igual de t de agua destilada estérilo hacer una concentración final de 4 mg / ml. Mantenga solución caliente a 35-40 ° C antes de su uso para evitar la precipitación de busulfano. Desechar la solución si se observa precipitación.
  5. Después de tratamiento con busulfano, espere por lo menos un mes antes de los destinatarios. Los destinatarios pueden utilizar entre 1 mes y 3 meses post-tratamiento de busulfano.

2. Preparación de pipetas de microinyección

  1. Elija pipetas de vidrio de borosilicato (tubos capilares) con un diámetro de 1,0 mm exterior, un 0,75 diámetro interior mm, y una longitud de 3 pulgadas.
  2. Siliconize pipetas de vidrio con Sigmacote, lavar pipetas con metanol y secar con aire.
  3. Tire de las pipetas con un extractor de pipeta. Diferentes máquinas de extractores de pipeta tienen distintos ajustes, por lo tanto, probar algunas opciones de configuración. Generalmente, un ajuste similar a la utilizada para la fabricación de pipetas enucleación puede trabajar.
  4. Rompa las puntas de pipeta con el microscopio de disección antes de su uso para lograr un diámetro de aproximadamente 50 micrasen la punta.

3. Preparación de células del donante para el trasplante

  1. Choise de la cepa donante es dependiente sobre la cuestión experimental estudiado. Si la cuantificación de la espermatogénesis se utiliza como criterio de valoración, el uso de donantes con un marcador genético fácilmente identificables como Lac-Z (por ejemplo, B6.129S7-Gt (ROSA) 26Sor / J de Jackson Laboratory) o GFP (por ejemplo, C57BL/6-Tg ( CAG-EGFP) 1Osb / J de Jackson Laboratory).
  2. Prepare 7 ml de colagenasa en DMEM a 1 ml mg / ml, 4 ml de tripsina-EDTA (0,25% de tripsina más EDTA 1mM), y 2 de DNasa en DMEM a 7 mg / ml. Esta cantidad es para la digestión de 2 testículos de ratón de los donantes.
  3. Recoger los testículos asépticamente y quitar la túnica albugínea. Unte los túbulos seminíferos con cuidado con unas pinzas finas para facilitar la digestión enzimática.
  4. Túbulos de transferencia en la colagenasa, incubar a 37 ° C durante 5-10 minutos, y se agita con frecuencia.
  5. Lavar dos veces al girar los túbulos (200-300 g por 3 min) y volver a suspender en PBS w / o Ca 2 + +
  6. Vuelva a suspender los túbulos de tripsina-EDTA y agitar hasta que se vuelve pegajoso y turbio. Monitorear la digestión de los túbulos a 37 ° C como debe ocurrir dentro de 1-2 min.
  7. Añadir DNasa y agitar bien. Incubar durante 1-2 minutos.
  8. Añadir 3 ml de FBS para detener la acción de las enzimas.
  9. Suspensión celular Filtro utilizando una malla de nylon con 40-70 micras de tamaño de poro para eliminar células / tejidos trozos.
  10. Recoger las células a 600 g durante 5 min y volver a suspender las células en una pequeña cantidad de DMEM (<100 l).
  11. Cuente las células y ajustar el volumen a una concentración final deseada (por lo general 100 x 10 6). Mantenga suspensión de células en hielo antes de su uso.
  12. Cada testículo de ratón tratados con busulfano se llenará con sólo 10-15 l de suspensión celular. Debido al potencial de los residuos y las fugas, el objetivo de tener 30 a 50 l por los testículos.

4. Trasplante de procedimiento (Figura 1)

  1. Anestesiar a los destinatarios siguientes protocolos aprobados.
  2. Lugar de dorsalesdecúbito y quirúrgicamente preparar la zona abdominal. Haga una incisión de 1 cm ~ la línea media abdominal para exponer la pared abdominal. Elevación de la pared abdominal mediante pequeñas pinzas en el punto de la línea blanca para evitar que accidentalmente hiriendo a los órganos abdominales, y proceder a hacer una incisión de 0,5 cm ~ en la línea media de la pared abdominal para exponer la cavidad peritoneal.
  3. Use una pinza de iris para sujetar la pared abdominal, y usar otro par de pinzas de iris para buscar las almohadillas de grasa conectados al testículo y del epidídimo en la cavidad peritoneal. Tire suavemente la almohadilla de grasa hasta que el testículo se exterioriza y la arteria testicular y del epidídimo son claramente visibles. El trabajo sobre un testículo a la vez.
  4. Coloque una sábana fina estéril compuesto de fichas autoclave por debajo de la almohadilla de grasa / testículo para una mejor identificación visual (opcional). El drapeado también trabaja para absorber fluido.
  5. Añadir una gota de tinte azul tripán en la suspensión de células de carga y con mucho cuidado la suspensión de células en el polyethytubería Lene conectado a una jeringa de 1 ml. Adjuntar la pipeta tirado en el tubo y suavemente forzar la suspensión de células en la pipeta mediante la aplicación de presión a la jeringa.
  6. Identificar los conductos eferentes (que conectan los testículos al epidídimo) y retire suavemente el tejido adiposo alrededor de los conductos. Trabaje con mucho cuidado, como los conductos y la membrana alrededor de ellos son translúcidos.
  7. Introduzca con cuidado la pipeta en un conducto en el conjunto de los conductos eferentes, suavemente enhebrar unos pocos milímetros hacia el testículo.
  8. Si bien evitando mover la pipeta de inyección, alcance para la jeringa, presione suavemente el émbolo de la jeringa para asegurarse de que la suspensión fluye en la rete testis y los túbulos seminíferos comienzan a llenar.
  9. La tasa de inyección y el flujo de la suspensión celular está regulado por la presión del pulgar. Evite el aumento repentino de la presión; vigilar el movimiento de suspensión en los túbulos.
  10. Detener la inyección, cuando casi todos los túbulos de la superficie que se hayan cubierto antes de que el testículo comienza a becOme isquémica.
  11. Vuelva a colocar el testículo a la cavidad abdominal. Repita el procedimiento en el testículo contralateral. Suturar la pared abdominal con sutura de seda 6-0 y cerrar la piel con pinzas de metal de la herida. Controlar los ratones en una almohadilla de calentamiento hasta su completa recuperación.

5. El análisis de los testículos receptores

  1. Espere entre 2-4 meses después del trasplante antes de su análisis.
  2. Sacrificar al ratón receptor de acuerdo a la atención de los animales y las directrices de uso y recoger el testículo y del epidídimo en PBS. Cuando una cepa de Lac-Z transgénico de donantes ha sido utilizado, el epidídimo se puede utilizar como un control de tinción positiva como lo ha hecho endógeno beta-galactosidasa actividad.
  3. Para la detección de las células del donante por el Lac-Z manchas, fijar el testículo durante 1-2 horas a 4 ° C en el 4% paraformaldehído (PFA) en PBS. Enjuague 3 x 30 min a temperatura ambiente en lacZ tampón de enjuague.
  4. Incubar durante una noche a 37 ° C en solución de tinción de lacZ. Testículos pueden ser teñidos en su conjunto o después de la dispersiónlos túbulos.
  5. Fijar y almacenar en un 10% formalina tamponada neutra. Si las secciones son necesarios utilizar el rojo neutro rápido como tinción de contraste.

PARTE B. ectópico xenoinjertos en ratones

(De Dobrinski Rathi y 2008 15, y Rodríguez-Sosa et al. 2011 16).

1. Colección de tejido de un donante

  1. Obtener tejido testicular por la castración o la biopsia de un varón de donantes.
  2. Coloque los testículos en PBS o biopsias en medio de cultivo, el mantenimiento de condiciones estériles.
  3. Mantenga el tejido recogido sobre hielo y el transporte al laboratorio.

2. Preparación de tejido de un donante

  1. Lleve a cabo en la campana cultivo de tejidos para mantener la esterilidad.
  2. Lavar cada testículo en helado de PBS antibióticos que contienen dos o tres veces antes de transferir a una cultura de plato con PBS. En el caso de las biopsias, lave fragmentos de testículos de dos a tres veces con helado de Medi culturaum que contenga antibióticos por girando a 150g durante 2 min y resuspender en medio fresco cultura hielo-frío.
  3. Para los testículos intactos, quite la túnica vaginal al hacer una incisión a lo largo de la superficie y la extrusión de los testículos. Eliminar de todas las estructuras testiculares anexos de cordón espermático, epidídimo, tejido conectivo). Lave los testículos una vez en PBS frío y la transferencia en una cultura de plato con PBS.
  4. Retire con cuidado la túnica albugínea del testículo mediante una hoja de bisturí y un par de tijeras. Si el testículo es muy pequeña, la túnica puede ser removido por apretar el tejido testicular fuera de la túnica a través de una pequeña incisión hecha en un extremo mientras sostiene la túnica con un par de pequeñas pinzas en el otro extremo.
  5. Dependiendo del tamaño de los testículos ya sea el tejido testículo entero se puede cortar en pedazos pequeños de alrededor de 1 - 2 mm 3 en tamaño utilizando fórceps curvos y una hoja de bisturí, o pedazos grandes de tejido testicular primero puede ser removido del testículo y, a continuación cortado en pequeñospiezas. Todo esto debe hacerse en medio de cultivo hielo-frío y bajo condiciones estériles en un plato de cultivo pequeña (60 x15 mm).
  6. Transferencia de los fragmentos de tejido preparadas al medio de cultivo de hielo frío en pequeños la cultura de los platos en hielo hasta que el injerto.

3. Castración de receptor del ratón

  1. Anestesiar a ratones que el anterior y preparar el campo quirúrgico estéril sujetando el cabello (no es necesario en ratones desnudos), limpiar con un 70% de etanol y una solución de Betadine.
  2. Haga un 0,5 -1 cm incisión en la piel ventral de la línea media para exponer la pared abdominal.
  3. Descubra con cuidado los testículos, la arteria testicular y del epidídimo como se describe en la Parte A, 4.2-4.3.
  4. Separar la cola del epidídimo los de la gubernaculum mediante disección roma.
  5. Ligar la arteria testicular y los vasos deferentes, junto con el vaso sanguíneo con la seda, y la sección de las estructuras ligadas mediante la reducción de entre el testículo y la ligadura.
  6. Repita el procedimiento para el second testículo.
  7. Suture la pared abdominal con una o dos puntadas quirúrgicas.
  8. Cierre la incisión de la piel con uno o dos clips de Michel.

4. Ectópico xenoinjerto

  1. Coloque el ratón en decúbito ventral y preparar un campo quirúrgico estéril en su parte posterior que el anterior.
  2. Dependiendo de cuántos injertos son para ser insertado (generalmente 4-8/mouse), hacer ~ 0.5 cm incisiones en la piel largos a cada lado de la línea de mediados de la parte posterior del ratón.
  3. Use unas pinzas para sostener el borde de la incisión de la piel, y hacer una cavidad subcutánea por las burlas aparte del tejido conectivo con unas tijeras.
  4. Uso de un lugar del iris fórceps un pedazo de tejido testicular profundamente en la cavidad subcutánea, la celebración de la frontera de la incisión de la piel con otro fórceps del iris.
  5. Cierre la incisión de la piel con un clip de Michel y mantener el ratón sobre la almohadilla de calor hasta que comience a recuperarse de la anestesia.
  6. Transferir el ratón en una jaula con un aislamiento adicional y cooperaciónversión y el monitor hasta que los ratones se recuperó por completo.

5. Colección de xenoinjertos de testículo para el análisis y la recolección de esperma

  1. Practicar la eutanasia con el ratón de acogida de acuerdo a la atención de los animales y las directrices de uso, y hacer una incisión en la piel la línea media en la piel corredor desde la cola hasta el cuello y la piel abierta. Esto expone a los injertos que pueden ser ubicados ya sea en el tejido subcutáneo o adherida a la piel.
  2. Retire con cuidado los injertos utilizando una pinza de par y un par de tijeras.
  3. Récord número de injertos recuperado, el tamaño y peso de los injertos individuales.
  4. Recuperar las vesículas seminales desde el abdomen del ratón y registrar su peso como una indicación de la producción de testosterona por el tejido injertado.
  5. Para el análisis histológico
    1. Suspender xenoinjertos en el vial de muestra que contiene la solución de Bouin (o fijador de otro tipo) en un volumen 10 veces ~ de la del xenoinjerto, y de manera apropiada etiqueta del vial.
    2. Incubardurante la noche en el refrigerador seguido por lavado al menos 3 veces en 70% de etanol a intervalos de 24 horas preferentemente.
    3. Proceder de procesamiento y la inclusión en parafina.
  6. Para la recolección de esperma
    1. Lave xenoinjertos por hilatura ellos abajo en 300g por 1 min y resuspender ellos en medio de cultivo que contengan antibióticos.
    2. Cortar los injertos en pequeños trozos y picar cuidadosamente con los fórceps en un plato de cultivo de tejido que contiene 3 a 5 ml de medio de cultivo.
    3. Tejido Filtro picada a través del colador micras 40 célula.

PARTE C. Los resultados representativos

1. El transplante de células germinales

Si la suspensión donante de células trasplantado contiene células espermatogonias madre que llevan un marcador genético, tales como el transgén LacZ, la colonización de las ESC donantes en los testículos receptores pueden ser visualizados por tinción con X-gal como distintivos segmentos azules del SEMiniferous túbulos después de 2-3 meses post-trasplante 3 (Figura 2A). Una colonia bien establecida debe tener un largo tramo oscuro azul de segmentos completamente llenas con dos o más capas de células azules más cerca del centro, y relativamente más débiles regiones manchadas en ambos extremos donde una red de emparejado sola, o pequeños grupos de células azules es aparente 3 (Figura 2B). Un corte transversal de la región de los túbulos seminíferos de color azul oscuro que revelan bien establecido y bien organizada la espermatogénesis con las células germinales de color azul en las etapas de diferenciación distintas (Fig. 2C).

2. Testículo tejido xenoinjerto

La viabilidad del tejido testicular después del trasplante se correlaciona inversamente con la etapa de desarrollo del donante; el mejor resultado se obtiene cuando el tejido de los varones recién nacidos se utiliza, mientras que el tejido adulto muestra una alta tendencia a degenerar y morir 17-21. Generalmente, el éxito xenoinjerto disminuye a medida que el tejido donante se somete a míiosis de la primera ola de la espermatogénesis. Tiempo para el pleno desarrollo de los tejidos de donantes inmadura y la espermatogénesis completa es específica de la especie, y, a menudo algo más corto en comparación con los testículos in situ. El número de túbulos seminíferos con espermatogénesis completa es variable según la especie. Mientras que en ovejas, cabras y cerdos que número es mayor que 50%, en el ganado vacuno y gatos es menos del 15% 14 (Figura 3).

Figura 1
Figura 1. Células germinales procedimiento de trasplante. Coloque las personas en decúbito dorsal después de la anestesia y hacer un ~ 0.4 pulgadas incisión abdominal de línea media (A). Exponer los testículos mediante la retirada de la almohadilla grasa adherida al epidídimo y los testículos y colocar un paño fino estéril por debajo de la almohadilla de grasa / testículo para una mejor identificación visual (B). Coloque el testículo y del epidídimo, para que los conductos eferentes enterrados en la almohadilla de grasa son discernibles (C, D, E). Identificaciónentidad de los conductos eferentes y retire suavemente el tejido adiposo alrededor de los conductos. Un pedazo de papel de color o de plástico se pueden colocar debajo de los conductos para una mejor visualización (G). Quiebre o moler la punta de la pipeta de acuerdo con el tamaño de los conductos y la suspensión célula de carga en la pipeta (H). Introduzca con cuidado la pipeta en un conducto en el conjunto de los conductos eferentes, suavemente enhebrar unos pocos milímetros hacia el testículo (la flecha en H muestra la dirección de la pipeta de inyección y roscado). Un testículo con la inyección de éxito en los túbulos seminíferos se muestra (I). T: Testículo; Ep: epidídimo.

Figura 2
Figura 2. Los resultados representativos para el trasplante de células germinales A) un testículo inyectados teñidas con X-gal. Los segmentos de color azul de los túbulos seminíferos representan las colonias establecidas de SSC donantes transgénicos (lacZ transgenes). B) Mayor aumento de una colonia de SSC a 3 meses post-trasplante. The oscura región de azul en el centro representa la espermatogénesis completa y las regiones de color azul pálido en los extremos representan una extensión cada vez mayor de la colonia. C) Un corte histológico de la oscuridad los túbulos seminíferos azul (3 meses post-trasplante) muestra la espermatogénesis bien organizado. Las barras de escala en B y C son 200 micras y 30 micras, respectivamente. (Figuras adaptado de Annu Rev Cell Biol. Dev. 2008;. 24:263-86 Reprod Biol 1999 y junio;. 60 (6) :1429-36).

Figura 3
Figura 3. Ectópico xenoinjerto de tejido testicular inmaduro de animales de gran tamaño en ratones inmunodeficientes. Los fragmentos de testículos inmaduros donantes (~ 1 mm 3) trasplantadas en la piel dorsal de ratones inmunodeficientes (A) son capaces de sobrevivir y responder a las gonadotropinas de ratón. Como resultado, el tejido testículo sufre desarrollo completo, incluyendo la formación de esperma fertilización competente (B). Una vez que se recogen los xenoinjertos de testículo (C)que pueden ser utilizados para su análisis o para obtener espermatozoides (D) para ICSI (E) y de producción de embriones (F). Bares igualdad de 50 micras (B, E y F) o 10 micras (D). (Modificado de Rodríguez-Sosa y Dobrinksi 2009 14).

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Discusión

1. El transplante de células germinales

Germen de trasplante de células proporciona el ensayo sólo funcional para la confirmación inequívoca de la presencia de células madre de espermatogonias (SSC) en una población celular. SSC Sólo en casa pueden y colonizar el nicho de cooperación Sur-Sur en la membrana basal e iniciar los donantes derivado de la espermatogénesis. El transplante de células germinales ha permitido estudiar y manipular las ESC de una manera sin precedentes. La técnica ha sido...

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Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Trabajo en el laboratorio los autores ha sido apoyado por el USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213), NIH / CNRR (2 R01 RR17359-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) y Alberta Innova - Soluciones para la Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo
La colagenasa (tipo IV) Sigma C5138
Tripsina-EDTA Invitrogen 25200-056
DNaseI Sigma DN25
DMEM Invitrogen 31053-028
Trypan mancha azul Invitrogen 15250-061
Malla de nylon filtro de células BD Biosciences 352.340 (40 micromolar)
352 350 (70μm)
Busulfano Sigma B2635
De pared delgada capilares de vidrio Mundial de instrumentos de precisión TW 100-3
BD intramedic tubo plyethylene (PE100) BD CA-63018-725
Ethicon 6-0 sutura de seda Ethicon 706G
Clips de la herida BD 427631
Sigmacote Sigma SL2
X-gal Sigma B4252
Ferrocianuro de potasio Sigma P9387
Ferricianuro de potasio Sigma P3667
cloruro de magnesio Sigma 208337
sodio desoxicolato Sigma D6750
N, N-Dimetilformamida Sigma D4551
Igepal CA-630 Sigma 18896

Referencias

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