Artículo de método

El diagnóstico de tuberculosis pulmonar con el Xpert MTB / RIF prueba

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DOI:

10.3791/3547

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9 de abril de 2012

 , 
1Institute for Infectious Diseases, University of Bern, 2MCL Laboratories Inc.

En este artículo

Resumen

El Xpert MTB / RIF prueba integra la descontaminación de la muestra, la operación de manos libres, a bordo de procesamiento de muestras, y ultra-sensible de PCR semi-anidada para la detección simultánea de Mycobacterium tuberculosis Resistencia a la rifampicina, ya sea en el esputo expectorado o sedimentos concentrados de esputo, en aproximadamente dos horas. La prueba es estandarizada y requiere una infraestructura de laboratorio sólo moderada y la formación.

Resumen

La tuberculosis (TB), debido a Mycobacterium tuberculosis (MTB) sigue siendo un importante problema de salud pública: la infección afecta a hasta un tercio de la población mundial 1, y casi dos millones de personas mueren por tuberculosis cada año 2 El acceso universal de alta calidad. , centrada en el paciente el tratamiento para todos los pacientes con TB se destaca por la OMS Estrategia Alto a la Tuberculosis. 3 La detección rápida de BTT en las muestras respiratorias y terapia con medicamentos basados ​​en resultados fiables de detección de drogas de resistencia son un requisito previo para la implementación exitosa de esta estrategia. Sin embargo, en muchas zonas del mundo, el diagnóstico de TB todavía se basa en métodos insensibles, microscopía de esputo poco estandarizados. Detección de la tuberculosis ineficaz y la aparición y transmisión de cepas resistentes a los medicamentos BTT cada vez más en peligro las actividades mundiales de lucha contra la tuberculosis. 2

El diagnóstico efectivo de la tuberculosis pulmonar requiere la disponibilidad - a escala mundial - del standnormalizadas y herramientas de diagnóstico fáciles de usar y robusto que permitan la detección directa de ambos el complejo MTB y la resistencia a los antibióticos clave, como la rifampicina (RIF). Este último resultado puede servir como marcador para multirresistente MTB (TB MDR) y ha sido reportado en> 95% de las cepas de TB-MDR. 4, 5 La rápida disponibilidad de resultados de las pruebas confiables es probable que se traducen directamente en el manejo del paciente de sonido decisiones que, en última instancia, va a curar al paciente individual y romper la cadena de transmisión de la tuberculosis en la comunidad. 2

Cefeida (Sunnyvale, CA, EE.UU.) Xpert MTB / RIF ensayo de 6, 7 cumple con las exigencias señaladas anteriormente de una manera notable. Es una prueba de amplificación nucleicos-ácidos por 1) la detección de ADN de MTB complejo en el esputo o sedimentos concentrados de esputo, y 2) la detección de RIF asociadas a la resistencia mutaciones del gen rpoB 8 Se ha diseñado para su uso con GeneXpert Cefeida DX. Sistema ªen integra y automatiza el procesamiento de muestras, la amplificación de ácido nucleico, y la detección de las secuencias diana mediante PCR en tiempo real y PCR transcriptasa inversa. El sistema consta de un instrumento, una computadora personal, un escáner de código de barras y el software precargado para ejecutar pruebas y ver los resultados. 9 Se emplea un solo uso y desechables Xpert MTB / RIF cartuchos que contienen los reactivos de la PCR y la sede del proceso de PCR. Debido a que los cartuchos son auto-contenido, la contaminación cruzada entre las muestras se elimina. 6 actuales métodos de amplificación de ácidos nucleicos para detectar MTB son complejas, requieren mucho trabajo, y técnicamente exigente. El Xpert MTB / RIF ensayo tiene el potencial de traer las pruebas de diagnóstico estandarizados, sensible y muy específica, tanto para la tuberculosis y la resistencia a los medicamentos de acceso universal en el punto de atención de la configuración 3, a condición de que será capaz de pagar. Con el fin de facilitar el acceso, la Fundación para Nuevos Diagnósticos Innovadores (FIND) ha negociado significativareducciones significativas de precios. Los actuales precios FIND-negociados, junto con la lista de países elegibles para los descuentos, están disponibles en la web. 10

Protocolo

Estándar 2 de las Normas Internacionales para la Tuberculosis estados cuidado de que todos los pacientes con sospecha de tuberculosis pulmonar debe presentar al menos dos muestras de esputo para examen bacteriológico. Cuando sea posible, al menos una mañana temprano muestra debe ser obtenida, como esputo recogido en este momento tiene el mayor rendimiento. 11 El Xpert MTB / RIF ensayo puede ser aplicado a las muestras de esputo o sedimentos concentrados preparados a partir de esputo expectorado inducido o esputos que son . ya sea bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) con baciloscopía positiva o negativa 6, 12, 13 El ensayo está diseñado para utilizarse con muestras de pacientes para los cuales hay sospecha clínica de tuberculosis pulmonar que tienen: 1) no ha recibido tratamiento antituberculoso, 2 ) tenían menos de 7 días de terapia, o 3) no han recibido tratamiento en los últimos 60 días. Ten en cuenta que no debe ser usado para monitorear los efectos de la terapia con medicamentos 7, porque el ADN bacteriano puede persistir después de la terapia antimicrobiana.

1. Las muestras de esputo expectorado

Nota: El proceso sólo muchos ejemplares de una sola vez, ya que hay GeneXpert sistema DX módulos disponibles para ejecutar la prueba!

  1. Marca cada uno de Xpert MTB / RIF cartucho con el ID de la muestra correspondiente.
  2. Transferir 1,0 ml de esputo expectorado a una cónica, con tapón de rosca del tubo con una pipeta de transferencia estéril. Alternativamente, la muestra completa se puede procesar en el original a prueba de fugas contenedor de recogida de esputos.
  3. Añadir 2,0 ml Xpert MTB / RIF reactivo Muestra (2:1, v / v) para el esputo expectorado utilizando una pipeta de transferencia estéril.
  4. Vuelva a colocar la tapa y agitar el tubo vigorosamente 10-20 Veces. Alternativamente, la mezcla puede ser vortex (30 segundos).
  5. Permitir el tubo en posición vertical durante 5 min a temperatura ambiente.
  6. Agite el tubo vigorosamente 10-20 veces. También puede utilizar un vórtice (30 seg).
  7. Permitir el tubo en posición vertical durante otros 10 minutos a temperatura ambiente.
  8. Inspeccione las muestras: las muestras deben ser licuado y sin grumos visibles de esputo.

2. Los sedimentos concentrados

Nota: El proceso sólo muchos ejemplares de una sola vez, ya que hay GeneXpert sistema DX módulos disponibles para ejecutar las pruebas!

  1. Marca cada uno de Xpert MTB / RIF cartucho con el ID de la muestra correspondiente.
  2. Transferir 1,5 ml Xpert MTB / RIF reactivo a una muestra cónica, con tapón de rosca del tubo con una pipeta de transferencia estéril.
  3. Añadir al menos 0,5 ml de sedimento concentrado al tubo de reactivo que contiene la muestra usando una pipeta de transferencia estéril.
  4. Vuelva a colocar la tapa y agitar el tubo de vigorously 10-20 veces. También puede utilizar un vórtice (30 seg).
  5. Permitir el tubo en posición vertical durante 5 min a temperatura ambiente.
  6. Agite el tubo vigorosamente 10-20 veces. También puede utilizar un vórtice (30 seg).
  7. Permitir el tubo en posición vertical durante otros 10 minutos a temperatura ambiente.
  8. Inspeccione las muestras: las muestras deben ser licuado y sin grumos visibles de esputo.

3. Carga del Xpert MTB / RIF Cartucho

Nota: Comience la prueba en 30 minutos de la adición de la muestra en el cartucho!

  1. Revise las etiquetas de la MTB Xpert / cartucho de RIF y el ID de la muestra.
  2. Abra la tapa del cartucho.
  3. Utilizando la pipeta de transferencia estéril suministrado, aspirar la muestra licuado en la pipeta de transferencia hasta que el menisco está por encima de la marca mínima y transferir la muestra en el puerto abierto del Xpert MTB / RIF cartucho.

Nota:Dispense lentamente para minimizar el riesgo de formación de aerosol!

  1. Cierre la tapa del cartucho.

4. Inicio de la prueba

Nota: Antes de comenzar la prueba, asegúrese de que el Sistema de GeneXpert Dx está equipado con el software GX2.1, y el Xpert MTB / RIF ensayo se importan en el software de 9!

  1. Encienda el ordenador y, a continuación, encienda el instrumento GeneXpert Dx.
  2. En el escritorio de Windows, haga doble clic en el icono de acceso directo GeneXpert Dx.
  3. Inicie sesión en el software del sistema GeneXpert Dx con su nombre de usuario y contraseña.
  4. En la ventana Sistema GeneXpert Dx, haga clic en Crear prueba. El cartucho de escaneo de código de barras el cuadro de diálogo.
  5. En el cuadro de ID de la muestra, lea o escriba el ID de la muestra.
  6. Explorar el código de barras en el Xpert MTB / RIF cartucho. La ventana de prueba que aparezca Crear.
  7. Haga clic en Inicio de prueba
  8. Abra la puerta del módulo de instrumento con la luz verde parpadea, y cargar el cartucho.
  9. Cierre la puerta. La prueba se inicia y la luz deja de parpadear y se mantiene constantemente en verde. Cuando la prueba haya finalizado, la luz se apaga.
  10. Espere hasta que el sistema libera la cerradura de la puerta al final de la carrera, a continuación, abra la puerta del módulo y retire el cartucho.
  11. Deseche los cartuchos utilizados en los contenedores de desechos apropiados de acuerdo a las prácticas habituales de la institución.

5. Los resultados representativos

Cada Xpert MTB / RIF cartucho incluye reactivos para la detección de MTB complejo y resistencia a RIF, así como un control de procesamiento de la muestra (CPE) para controlar el procesamiento adecuado de las bacterias diana y para controlar la presencia de inhibidor de la (s) en la reacción de PCR . El control de comprobación de sonda (PCC) verifica la rehidratación reactivo, tubo de PCR rellenandoel cartucho, la estabilidad integridad de la sonda, y el tinte. 9 Los cebadores en el Xpert MTB / RIF ensayo amplificar una porción del gen rpoB que contiene el par 81 de base "núcleo" región. Cinco de diferente color fluorogénicos sondas de hibridación de ácidos nucleicos, llamados balizas moleculares, interrogar toda la 81-pb núcleo. 14 Cada baliza molecular fue diseñado para ser tan específica que no se une a su destino si la secuencia diana difiere de la de tipo salvaje rpoB secuencia por tan poco como una sustitución de un solo nucleótido. Desde fluorescencia molecular balizas sólo cuando están unidos a sus objetivos, es decir, de tipo salvaje secuencia rpoB, la ausencia de cualquiera de los cinco colores en el ensayo de diferenciar entre la conservadas secuencia del tipo salvaje y las mutaciones en la región del núcleo que están asociados con resistencia a RIF. 6

La RCP debe ser positivo en una muestra negativa y puede ser negativo o positivo en una muestra positiva. La pruebaresultado será "no válida" si el CPE no se detecta en una prueba negativa. Antes del inicio de la reacción de PCR, el Sistema GeneXpert Dx mide la señal de fluorescencia de las sondas para controlar la rehidratación talón, el llenado de reacción de tubo, la integridad de la sonda y la estabilidad del colorante. El PCC pasa si la señal de fluorescencia de las sondas cumple con los criterios de aceptación asignadas. Los resultados son interpretados por el sistema de GeneXpert Dx de las señales de fluorescencia medidos y algoritmos de cálculo integradas y se muestran en la ventana de resultados 9, como se indica a continuación:

MTB Detectado: ADN diana se detecta MTB; ambos controles, SPC y el PCC, cumplir con los criterios de aceptación asignadas. Los valores más bajos de Ct representan una mayor concentración de partida de molde de DNA; valores más altos de Ct representan una menor concentración de molde de ADN. En los resultados de MTB detectados "resistencia a RIF DETECTED" (Figura 1A), "NO DETECTA resistencia a RIF" (

BTT no se detecta: el ADN de MTB de destino no se detecta, tanto en los controles, SPC y el PCC, cumplir con los criterios de aceptación asignadas (Figura 2).

Inválido: La presencia o ausencia de MTB no se puede determinar: SPC no cumple con los criterios de aceptación, es decir, la muestra no ha sido procesada correctamente, o PCR fue inhibida (Figura 3). Nota: repetición de la prueba con la muestra extra!

Error: Uno o más de los resultados fallidos del PCC (FAIL). Tanto BTT y SPC muestra ningún resultado. Nota: repetición de la prueba con la muestra extra! Si el PCC pasado (PASS), el error está causado por un fallo de un componente del sistema.

Figura 1: ADN MTB blanco es detectado, tanto en los controles, SPC y el PCC, cumplir con los criterios de aceptación asignadas. Los valores más bajos de Ct representa una partida más altaconcentración de ADN molde; valores más altos de Ct representan una menor concentración de molde de ADN. En los resultados de MTB detectado "no resistencia a RIF DETECTED" (Figura 1A), "resistencia a RIF DETECTED" (fig. 1B), o "resistencia a RIF INDETERMINADO" se mostrará en una línea separada.

Figura 1A
. Figura 1A MTB DETECTADO; resistencia a RIF NO DETECTA, es decir, sólo la de tipo salvaje secuencia de ácido nucleico de la RIF de 81 pb resistencia a la determinación de la región (RRDR) del gen rpoB estaba presente 6. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 1B
. Figura 1B MTB DETECTADO; resistencia a RIF DETECTADO. Completa abandonar la Probe B (flecha), que cubre las posiciones 513 a 517 de la R RDR del gen rpoB. 6 En el ejemplo, la secuenciación parcial reveló que la mutación del gen rpoB D516V se detectó. 8 Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2
Figura 2 ADN MTB objetivo no se ha detectado,.. Ambos controles, SPC y el PCC, cumplir con los criterios de aceptación asignados Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 3
. Resultado la Figura 3 la prueba no válida, es decir, presencia o ausencia de MTB no se puede determinar: SPC no cumple con los criterios de aceptación, ya que la muestra no ha sido procesada correctamente, o porque se inhibe la PCR.3547fig3large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande figura.

Discusión

El Xpert MTB / RIF ensayo integra la descontaminación de la muestra, la operación de manos libres, a bordo de procesamiento de muestras, y ultra-sensible de PCR semi-anidada para la detección simultánea de MTB y la resistencia a RIF, ya sea en el esputo expectorado o sedimentos concentrados, en un solo , sistema fácil de usar. El ensayo analítico límite de detección se encontró que era 131 ufc / ml de esputo. 6 La relación log-lineal entre los valores de Ct y el número de células presentes MTB es válido desde 02 10 hasta julio 10 UFC / ml de esputo. Como las concentraciones de BTT clínicamente relevantes están comprendidos dentro del rango lineal del ensayo, el ensayo proporciona estimaciones semicuantitativas de la carga bacteriana. 7 El ensayo requiere infraestructura de laboratorio sólo moderada y la formación. El límite de detección se encuentra al menos dos órdenes de magnitud menor que la de microscopía convencional. 6 Especificidad es excelente. Por otra parte, la detección simultánea de RIF-resist MTB es un beneficio significativo en la configuración de las pruebas de punto de atención en la era de la tuberculosis farmacorresistente. 3

Hasta la fecha pocos datos publicados sobre los resultados del ensayo de para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar en la práctica clínica están disponibles 12, 13. El Xpert MTB / RIF ensayo de la sensibilidad clínica global de detección de MTB en el esputo de los pacientes con tuberculosis pulmonar se sospecha fue del 97,6% en comparación con la cultura como referencia. Estos fueron los resultados de un estudio prospectivo multicéntrico que incluyó cinco sitios de estudio (Lima, Perú; Bakú, Azerbaiyán, Ciudad del Cabo y Durban, Sudáfrica, Mumbai, India) y un total de 1462 pacientes. El total de probabilidad pretest de la cultura-confirmó la tuberculosis en la población estudiada fue de 50,7%. La sensibilidad fue del 99,8% para los casos con baciloscopia y cultivo positivo y 90,2% para baciloscopia negativa, los casos con cultivo positivo. Entre los pacientes VIH-positivos con tuberculosis pulmonar, la sensibilidad de la prueba MTB / RIF fue del 93,9%, en comparación con el 98,4% enEl VIH-negativos pacientes de 12 En un entorno de baja prevalencia de la tuberculosis, el acuerdo global para la detección de MTB fue del 89% en comparación con la cultura, la sensibilidad fue del 98% para% con baciloscopia positiva y 72 para las muestras con baciloscopia negativa, respectivamente, y el especificidad fue excelente. 13 No hubo diferencia significativa en la sensibilidad entre las pruebas de esputo sin tratar y los de los sedimentos concentrados. 12 En el mismo estudio, la prueba MTB / RIF detecta correctamente la resistencia a RIF en 209 de los 211 pacientes (99,1% de sensibilidad) y en todos los 506 pacientes con susceptibilidad de RIF (100% de especificidad), cuando los resultados de la secuenciación se han tenido en cuenta. 12 Los autores encontraron que el rendimiento de la detección de casos ambos, y la discriminación de la resistencia a RIF, fue similar en los diversos sitios, lo que sugiere que los resultados es probable que ser ampliamente aplicable. 12 Además, los sedimentos concentradas de muestras respiratorias que no sean esputo, tales como lavado broncoalveolar y bronquiossecreciones l, se pusieron a prueba con una sensibilidad y especificidad comparable. 13 Los datos sobre las cualidades del ensayo de prueba, cuando la tuberculosis extrapulmonar está emergiendo. 15

Control de la tuberculosis mundial necesita urgentemente instrumentos eficaces que permitan el diagnóstico rápido de nuevos casos de tuberculosis y la detección de la RIF-resistente a la BTT, en el punto de acceso universal de los entornos de atención. 3 Los actuales métodos de amplificación de ácidos nucleicos para detectar MTB son complejas, mano de obra, y técnicamente exigente. El Xpert MTB / RIF ensayo tiene el potencial de traer las pruebas de diagnóstico estandarizados, sensible y muy específica, tanto para la tuberculosis y la resistencia a los medicamentos en estos valores, a condición de que será capaz de pagar. Con el fin de facilitar el acceso, la Fundación para Nuevos Diagnósticos Innovadores (FIND) ha negociado reducciones de precios significativas para el Xpert MTB / RIF prueba. Los actuales precios FIND-negociados, junto con la lista de países elegibles para los descuentos, están disponibles en la web. 10

Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Los autores reconocen WJ Looney por su cuidadosa revisión del manuscrito.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivo / Equipo Empresa Número de catálogo
Xpert MTB / RIF prueba Cepheid GXMTB/RIF-10
Pipetas de transferencia Sarstedt 86.1172.001
Tubos cónicos, de 15 ml, 120 x 17 mm, PS Sarstedt 62.553.542

Referencias

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