La evaluación de la hipermutación somática en Ramos células B después de sobreexpresión o derribo de genes específicos

Resumen

Se describe cómo realizar las infecciones por retrovirus o lentivirus de la sobreexpresión o siRNA que contienen las construcciones en la línea de Ramos humanos de células B y la forma de medir la hipermutación somática en estas células.

Resumen

Las células B comienzan su vida con los anticuerpos de baja afinidad generado por V (D) J recombinación. Sin embargo, al detectar un patógeno, la variable (V) la región de una inmunoglobulina (Ig) del gen se encuentra mutado aproximadamente 100.000 veces más que el resto del genoma a través de hipermutación somática (SHM), resultando en una alta afinidad ^1,2 anticuerpos. Además, la recombinación de cambio de clase (CSR) produce anticuerpos con diferentes funciones efectoras dependiendo del tipo de respuesta inmune que se necesita para un patógeno en particular. Tanto la RSE y SHM se inician por la citidina deaminasa inducida por activación (AID), que desamina residuos de citosina en el ADN para producir uracilos. Estos uracilos son procesados ​​por las formas propenso a errores de las vías de reparación, con el tiempo provocando mutaciones y recombinación ^3.1.

Nuestra actual comprensión de los detalles moleculares de SHM y RSE provienen de una combinación de estudios en ratones, las células primarias, las líneas celulares, y el F-Cellexperimentos de REE. Modelos de ratones siguen siendo el estándar de oro con nocauts genética que muestra un papel crítico para la reparación de muchos factores (por ejemplo, Ung, MSH2, MSH6, Exo1, y de la polimerasa η) ^4-10. Sin embargo, no todos los genes se prestan a los estudios de octavos de final. Por ejemplo, golpes de gracia de varios de doble filamento romper las proteínas de reparación son embrionariamente letal o poner en peligro el desarrollo de células B ^14/11. Por otra parte, a veces la función específica de una proteína en SHM o CSR pueden estar enmascarados por más defectos global causado por el golpe de gracia. Además, puesto que los experimentos en ratones pueden ser largos, alterando la expresión de genes individuales en las líneas celulares se ha convertido en un primer paso cada vez más popular para la identificación y caracterización de genes candidatos ^15-18.

Ramos - un linfoma de Burkitt línea celular que constitutivamente se somete a SHM - ha sido una popular línea celular modelo para estudiar SHM ^18-24. Una de las ventajas de las células de Ramos es que tienen una semi-construido en práctica-Cuantitativa medida de SHM. Las células de tipo salvaje expresa IgM y, como recogen las mutaciones, algunas de las mutaciones eliminar la expresión de IgM. Por lo tanto, analizando la pérdida de IgM mediante el escaneo de células activadas por fluorescencia (FACS) proporciona una rápida lectura para el nivel de SHM. Una medición más cuantitativa de la SHM se puede obtener por secuenciación directa de los genes de anticuerpos.

Dado que las células Ramos son difíciles de transfectar, producimos derivados estables que han aumentado o reducido la expresión de un gen individual al infectar las células con las construcciones retrovirales o lentiviral que contienen un casete de sobreexpresión o una corta horquilla de ARN (siRNA), respectivamente. Aquí se describe la forma en que infectan a las células Ramos y luego utilizar estas células para investigar el papel de genes específicos en el SHM (Figura 1).

Protocolo

1. Preparación de muestras y las células

1. Realizar una preparación mediana escala de ADN (Midiprep) de la sobre-expresión o siRNA que contienen las construcciones y la retroviral vector pKat2 envases o embalajes de los vectores lentiviral pVSV-G, pMDLg / pRRE, y PRSV-Ap ^25. Use 6 mg de ADN para construir cada uno y ya sea de 4 mg de pKat2 (para las infecciones por retrovirus) o 1,5 mg de ADN de cada uno de los pVSV-g, pMDLg / pRRE, y PRSV-Rev vectores de embalaje (para las infecciones por lentivirus).
2. Prepare BOSC 23 medios de comunicación. Para la transfección, se usan ambas enmendada Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), así como DMEM ....

Discusión

Como se mencionó anteriormente, los modelos de líneas celulares para la diversificación de anticuerpos se han convertido en un popular punto de partida para identificar nuevas proteínas que influyen en los diferentes pasos en la diversificación de anticuerpos. En este trabajo presentamos un método para el uso de la infección viral a las proteínas ya sea derribo o sobre-expresan en los Ramos de células B línea y luego examinar el impacto en SHM.

Para estos estudios, que utilizan tanto el TE R.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
6-y claro TC tratados con placas	Corning	3516
10 ml BD Luer-Loksyringes	BD Medical	309604
24-alejado TC-tratados placas	Corning	3526
De 96 pocillos de poliestireno claro fondo plano TC-tratados microplacas	Corning	3596
100 mm TC-tratados placas de cultivo	Corning	430167
Filtros de jeringa Acrodisc, 0,45 m	Pall Life Sciences	4604
Agar	Teknova	A7777
Agarosa	GeneMate	E-3120-500
Ampicilina	Sigma	A0166	100 mg / ml en agua
BD FACSCanto II citómetro de flujo	BD Biosciences		o similar
BD Falcon tubos redondos inferior de poliestireno	BD Biosciences	352054	por FACS
BOSC 23 celdas	ATCC	CRL-11270
CO 2 capaz de incubadora a 37 ° C
DMEM (Dulbecco modificado de Eagle)	Sigma	D6429
FBS (suero fetal bovino)	Gemini Bio-productos	100-106
FITC α-rata CD90/mouse CD90.1 anticuerpos	BioLegend	202503	FITCα-Thy1.1
FuGENE 6 Transfección reactivo	Roche	11814443001
Solución tampón HEPES	Invitrogen	15630-080
KAPA HiFi ADN polimerasa	KAPA Biosystems	KK2101
LB caldo (caldo de lisogenia - Luria) en polvo	Difco	240230
MISIÓN TRC ARNhc acciones glicerol bacteriana	Sigma		ARNhc vectores
NCS (suero de ternera recién nacido)	Gemini Bio-productos	100-504
PBS (solución buffer fosfato)	Invitrogen	70011	diluye a 1x en el agua
PE-α humana de anticuerpos IgM	BioLegend	314508
PGS (penicilina-estreptomicina-glutamina solución)	Gemini Bio-Productos	400-110
Polybrene (Hexadimetrina bromuro)	Sigma	107689	10 mg / ml en agua
PureYield plásmido sistema Midiprep	Promega	A2495
Puromicina	Sigma	P8833	250 pg / mL en el agua
QIAquick gel extracción kit	QIAGEN	28706
Ramos (AR 1) las células	ATCC	CRL-1596
RPMI-1640	Sigma	R8758
Superíndice II	Invitrogen	18064-022
SYBR RÁPIDO qPCR kit	KAPA Biosystems	KK4601
Taq ADN polimerasa	Invitrogen	18038-042
TOPO TA kit de clonación	In vitrogeneración	K4520-01
TRIzol	Invitrogen	15596-026
Asistente de purificación de ADN genómico SV sistema	Promega	A2361
X-Gal [5-bromo-4-cloro-3-β-indoyl-D-galatopyranoside]	Growcells	C-5687	40 mg / ml en DMSO