Demostramos cómo configurar un In vitro Isquemia / reperfusión modelo y la forma de evaluar el efecto de la terapia con células madre en células cardíacas postisquémica.
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Artículo de método
Trasplante de células madre en un In vitro Simulación de isquemia / reperfusión modelo
En este artículo
Resumen
Resumen
El trasplante de células madre protocolos están encontrando su camino en la práctica clínica 1,2,3. Obtener mejores resultados, por lo que los protocolos más robustos, y la búsqueda de nuevas fuentes de células implantables son el foco de las investigaciones recientes 4,5. La investigación de la eficacia de las terapias con células no es una tarea fácil y se necesitan nuevas herramientas para investigar los mecanismos implicados en el proceso de tratamiento 6. Hemos diseñado un protocolo experimental de isquemia / reperfusión con el fin de permitir la observación de las conexiones celulares y los mecanismos subcelulares incluso durante la lesión por isquemia / reperfusión y después del trasplante de células madre y para evaluar la eficacia de la terapia celular. H9c2 células cardiomyoblast se colocaron en placas de cultivo celular 7,8. La isquemia se simuló con 150 minutos en un medio de glucosa libre con el nivel de oxígeno por debajo del 0,5%. Entonces, los medios de comunicación normales y los niveles de oxígeno se volvieron a introducir para simular la reperfusión. Después de la falta de oxígeno la glucosa,las células dañadas fueron tratados con trasplante de médula ósea humana etiquetados derivados de células madre mesenquimales mediante su inclusión en la cultura. Las células madre mesenquimales son las preferidas en los estudios clínicos porque son de fácil acceso con la cirugía mínimamente invasiva, ampliable fácilmente y autólogo. Después de 24 horas de co-cultivo, las células fueron teñidas con calceína y homodímero de etidio-para diferenciar entre células vivas y muertas. Esta configuración nos permite investigar las conexiones intercelulares mediante microscopía confocal de fluorescencia y para cuantificar la tasa de supervivencia de las células postisquémica por citometría de flujo. La microscopía confocal mostraron las interacciones de las dos poblaciones de células, como la fusión celular y la formación de los nanotubos intercelulares. Análisis de citometría de flujo reveló tres grupos de células dañadas que se pueden representar en un gráfico y se analizaron estadísticamente. Estas poblaciones pueden ser investigados por separado y se pueden sacar conclusiones sobre estos datos sobre la eficacia de la simulaciónenfoque terapéutico.
Protocolo
1. Preparación de las células H9c2 cardiomyoblast
H9c2 cardiomyoblasts rata se obtuvieron de ATCC (Wesel, Alemania) y ampliado en el alto nivel de glucosa (4,5 g / L) DMEM con 10% de suero fetal bovino, 4 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina y estreptomicina 100 mg / ml. La línea de mioblastos H9c2 células se deriva de corazón de rata embrionaria, que se utiliza como un modelo in vitro para ambos músculo esquelético y cardíaco 8,9.
Prepare 12 y placa de células H9c2:
- Quitar medio de cultivo de una placa de Petri de células H9c2.
- Lavar las células dos veces con 5 ml de PBS y ....
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Discusión
El protocolo se ha demostrado un enfoque in vitro a la cuestión mucho más compleja de la terapia celular en infarto de miocardio, con todas las ventajas y desventajas de este modelo. Obviamente, no puede reflejar el complejo (inmunológicos, por ejemplo) los acontecimientos que ocurren durante y después del infarto de miocardio, pero puede centrarse en los efectos directos de las células añadido en las células postisquémica. Los efectos de la isquemia simulada en H9c2 cardiomyoblasts dependen en gran medida el momento de.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por OTKA (Fondo de Investigación Científica de Hungría) D45933, T049621, TET (húngaro Fundación de Ciencia y Tecnología) A4/04, Arg-17/2006 y el SIN, Bolyai, Becas y Öveges TÁMOP 4.2.2-08 / 1 / KMR-2008-0004 y 4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83803. Nos gustaría dar las gracias a William Gesztes para proporcionar la voz en off.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| calceína-AM | Las sondas moleculares | L3224, C3099 | http://www.invitrogen.com |
| homodímero de etidio-2 | Las sondas moleculares | L3224, E3599 | http://www.invitrogen.com |
| ¿SABÍA Vybrant | Las sondas moleculares | V22887 | http://www.invitrogen.com |
Tabla 1. Reactivos.
| Nombre del equipo | Empresa | Comentarios (opcional) |
|---|---|---|
| Celular PECON incubación sistema de microscopios Zeiss | PECON GmbH | www.pecon.biz/ |
Tabla 2. Equipo.
Referencias
- Dimmeler, S., Burchfield, J., Zeiher, A. M. Cell-Based Therapy of Myocardial Infarction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, (2008).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: A review. Journal of Neuroscience Research.
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Reimpresiones y permisos
