Análisis de Expresión de mamíferos enlazador histonas subtipos

Summary

Se describe un conjunto de ensayos para analizar los niveles de expresión de las histonas H1 enlazador. ARNm de genes H1 individuales se mide cuantitativamente por transcripción inversa aleatoria cebador basado seguido por PCR en tiempo real, mientras que la cuantificación de proteínas de las histonas H1 se logra mediante análisis por HPLC.

Abstract

Histona H1 vinculador se une a la partícula central del nucleosoma y el ADN enlazador, lo que facilita el plegamiento de la cromatina en la estructura de orden superior. H1 es esencial para el desarrollo de mamíferos ¹ y regula la expresión de genes específicos in vivo ^2-4. Entre las proteínas histonas altamente conservadas, la familia de las histonas H1 linker es el grupo más heterogéneo. Hay 11 subtipos H1 en los mamíferos que son regulados diferencialmente durante el desarrollo y en diferentes tipos celulares. Estos subtipos H1 H1 somáticas son: 5 (H1a-e), el reemplazo de H1 ^0, 4 subtipos de células germinales específicos H1, ​​y H1X ^5. La presencia de los subtipos H1 múltiples que difieren en su afinidad de unión al ADN y la capacidad de compactación de la cromatina ^6.9 proporciona un nivel adicional de modulación de la función de la cromatina. Así, el análisis cuantitativo de expresión de los subtipos H1 individuales, tanto de ARNm y proteínas, es necesario para una mejor comprensión de la regulación de la mayorPara estructura de la cromatina y la función.

Aquí se describe una serie de ensayos diseñados para el análisis de los niveles de expresión de los subtipos H1 individuales (Figura 1). la expresión de mRNA de varios genes H1 variante se mide por un conjunto de alta sensibilidad y cuantitativa de la PCR con transcripción inversa (QRT-PCR), que son más rápidos, más precisos y requieren muestras y mucho menos en comparación con el enfoque alternativo de análisis de Northern blot. A diferencia de la mayoría de los otros mensajes de ARNm celulares, ARNm para genes de la mayoría de las histonas, incluyendo la mayoría de los genes H1, ​​carecen de una larga cola poli, pero contienen una estructura tallo-bucle en la región 3 'no traducida (UTR) ^10. Por lo tanto, los ADNc se preparó a partir de ARN total por transcripción inversa usando cebadores al azar en lugar de cebadores oligo-dT. En tiempo real ensayos de PCR con primers específicos para cada uno de los subtipos H1 (Tabla 1) se llevan a cabo para obtener la medición altamente cuantitativa de los niveles de mRNA de subtipo H1 personas. La expresión de los genes de limpieza se analizan como controles para la normalización.

La abundancia relativa de las proteínas de cada subtipo H1 y histonas se obtiene mediante cromatografía líquida en fase inversa de alto rendimiento (CLAR) de análisis de las histonas total extraído de células de mamífero ^11-13. El método HPLC y condiciones de elución descrito aquí dan separaciones óptimas de los subtipos H1 del ratón. Al cuantificar el perfil de HPLC, se calcula la proporción relativa de los subtipos H1 H1 individuales dentro de la familia, así como determinar la relación entre nucleosoma H1 en las células.

Protocol

1. Preparación de la muestra y la extracción de RNA

1. Antes de la extracción de RNA, todas las superficies de trabajo y pipetas deben limpiarse con 70% de etanol y se trató con solución descontaminante RNasa, tales como la RNasa Zap. Esta práctica reduce las posibilidades de contaminación RNasa y la degradación del ARN. Use guantes para todos los procedimientos.
2. Para extraer el ARN de tejidos de ratón, diseccionar el órgano de interés de ratón la eutanasia, y lavar los tejidos en presencia de fosfato helada salino tamponado (PBS: 0,13 M NaCl, 5 mM de fosfato de sodio dibásico heptahidratado, 5 mM de sodio dihidrógeno heptahidratado, pH 7,4) . Proce....

Discussion

El conjunto de ensayos que aquí se presenta permitir el análisis exhaustivo de los niveles de expresión de mamíferos subtipos de histonas linker. Correctamente diseñados QRT-PCR proporcionar mediciones de alta sensibilidad y precisión de los mensajes de ARN de los genes histona H1 de mamífero. La parte crítica de la QRT-PCR para los genes del subtipo enlazador histonas es la preparación de cDNA utilizando cebadores aleatorios basados ​​en la transcripción inversa. ARNm de genes más histonas, incluyendo los genes H1, la .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
RNasa Zap	Applied Biosystems	AM9780
Reactivo Trizol	Invitrogen	15596-018
SuperScriptIII	Invitrogen	18080-051
Etanol absoluto	Fisher Scientific	BP2818-4
IQ SYBR Green	Bio-Rad	170-8880
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Desoxirribonucleasa I	Sigma	AMP-D1
Microseal placas de 96 pocillos PCR	Bio-Rad	MSP-9605
Los sellos adhesivos 'B' Microseal	Bio-Rad	MSB-1001
Sacarosa	Agros Organics	AC40594
El fosfato de sodio dibásico heptahidratado (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O)	Fisher Scientific	BP332
Cloruro sódico (NaCl)	América Bioanalítica	AB01915
Dihidrógeno de sodio heptahidratado (NaH 2 PO 4 · 7H2O)	Fisher Scientific	BP-330
HEPES	Fisher Scientific	BP310
Completa el inhibidor de la proteasa cóctel mini tablet	Roche Ciencias Aplicadas	11836153001
EDTA	Sigma	E-5134
Fenilmetanosulfonilo fluoruro (PMSF)	América Bioanalítica	AB01620
Nonidet-40 (NP-40)	América Bioanalítica	AB01425
El cloruro de potasio (KCL)	Fisher Scientific	BP366
Tris [hidroximetil aminometano]	América Bioanalítica	AB02000
Cloruro de magnesio (MgCl2)	Fisher Scientific	BP214
El ácido sulfúrico (H2SO4)	VWR	VW3648-3
De hidróxido de amonio (NH 4 OH)	Agros Organics	AC42330
Bradford ensayo de proteínas	Bio-Rad	500-0001
Acetonitrilo	EMD	AX0145-1
Ácido trifluoroacético (TFA)	JT Baker	9470-01