Confirmación vía metabólica y el descubrimiento a través de 13 C-etiquetado de proteinogenic Aminoácidos

Resumen

¹³ C-etiquetado de isótopos es una técnica útil para determinar el metabolismo de la célula central para varios tipos de microorganismos. Después las células han sido cultivadas con un sustrato marcado, GC-MS medición puede revelar las vías metabólicas funcional basada en los patrones de etiquetado único en proteinogenic aminoácidos.

Resumen

Los microbios tienen complejos procesos metabólicos que pueden ser investigados con métodos genómica bioquímica y funcional. Una técnica importante para examinar el metabolismo celular central y descubrir nuevas enzimas es de ¹³ C con ayuda de análisis de metabolismo 1. Esta técnica se basa en el etiquetado isotópico, en el que los microbios se alimentan con un ¹³ sustratos C etiquetados. Al trazar las rutas de transición entre el átomo de metabolitos en la red bioquímica, podemos determinar las vías funcionales y descubrir nuevas enzimas.

Como un método complementario a la transcriptómica y proteómica, los enfoques de isotopomer análisis asistido de las vías metabólicas contiene tres pasos principales ^2. En primer lugar, crecen las células con ¹³ substratos C etiquetados. En este paso, la composición del medio y la selección de sustratos marcados son dos factores clave. Para evitar los ruidos de medición de carbono no llevan la etiqueta en los suplementos nutricionales, Un medio mínimo con una única fuente de carbono es necesario. Además, la elección de un sustrato marcado se basa en la eficacia con que aclarará el camino que se analiza. Debido a nuevas enzimas a menudo implican estereoquímica reacción diferente o productos intermedios, en general, solo etiquetados sustratos de carbono son más informativos para la detección de nuevas vías que los etiquetados de manera uniforme para la detección de ^tres nuevas ^{vías, 4.} En segundo lugar, se analizan los patrones de amino ácido etiquetado con GC -MS. Los aminoácidos son abundantes en proteínas y por lo tanto se puede obtener a partir de la hidrólisis de la biomasa. Los aminoácidos pueden ser derivado de N-(terc-butildimetilsilil)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) antes de la separación GC. TBDMS aminoácidos derivado puede ser fragmentado por los Estados miembros y dar lugar a matrices diferentes de fragmentos. Sobre la base de la masa de carga (m / z) La proporción de aminoácidos fragmentados y no fragmentados, podemos deducir los posibles patrones de los metabolitos de la etiqueta central que seprecursores de los aminoácidos. En tercer lugar, se traza la transición 13C de carbono en las vías propuestas y, en base a los datos isotopomer, confirme si estas vías están activas ^2. La medición de aminoácidos proporciona información sobre el etiquetado isotópico ocho metabolitos precursores crucial en el metabolismo central. Estos nodos clave del metabolismo pueden reflejar las funciones de los asociados vías centrales.

¹³ C-análisis asistido por el metabolismo de los aminoácidos a través de proteinogenic puede ser ampliamente utilizado para la caracterización funcional del metabolismo microbiano caracterizado mal ^1. En este protocolo, vamos a utilizar Cyanothece 51142 como la cepa modelo para demostrar el uso de sustratos de carbono marcado por el descubrimiento de nuevas funciones enzimáticas.

Protocolo

1. De cultivo de células (Figura 1)

1. Se cultivan las células en medio mínimo con los elementos traza, sales, vitaminas, y específicamente etiquetados sustratos de carbono que son los mejores para la investigación de la vía. Utilizar cualquiera de frascos de agitación o bioreactores para el cultivo celular. Los nutrientes orgánicos, tales como extracto de levadura, puede interferir con la medición de etiquetado de aminoácidos y por lo tanto no pueden estar presentes en el medio de cultivo.
2. Controlar el crecimiento celular por la densidad óptica de la cultura en una longitud de onda óptima (por ejemplo, OD ₇₃₀ para Cyanothece 51.....

Discusión

Este protocolo consiste en alimentar la celda con un sustrato marcado y medición de los patrones resultantes isotópica de etiquetado en los aminoácidos a través de GC-MS. Desde MS de datos (m / z ratios) dar la cantidad total de etiquetado de los iones de MS, tenemos que evaluar las distribuciones de isotopomer de aminoácidos mediante el examen de la m / z ratios de ambos no fragmentado (M-57) ⁺ y fragmentado aminoácidos (es decir, (M-159) y ⁺ (F302) ^+). Además, podemos realizar varias c.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
TBDMS	Sigma-Aldrich	19915	-
THF	Sigma-Aldrich	34865	-
De carbono marcado sustrato	Cambridge Laboratorios de isótopos	Dependen del requisito experimental	Sitio Web: http://www.isotope.com
Cromatógrafo de gases	Agilent Technologies	Hewlett-Packard, modelo 7890A	-
GC Columnas	J & W Scientific, Folsom, CA	DB5 (30)	-
Espectrómetro de masas	Agilent Technologies	5975C	-
Reactivación-Vap EvaporAtor	Thermo Scientific	TS-18825	Para el secado de las muestras de aminoácidos