Un sistema 3D de los condrocitos articulares humanos en cultivo de altos niveles de líquido sinovial se describe. El líquido sinovial refleja el microambiente más naturales para el cartílago articular, y puede ser fácilmente obtenido y almacenado. Así, este sistema puede ser utilizado para el estudio de la regeneración del cartílago y de terapias de detección para el tratamiento de la artritis.
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Artículo de método
Un sistema 3D para los condrocitos articulares humanos cultivo de líquido sinovial
En este artículo
Resumen
Resumen
Destrucción del cartílago es una característica central patológicas de la artrosis, la principal causa de discapacidad en los EE.UU.. Cartílago en el adulto no se regenera de manera muy eficiente en vivo, y como consecuencia, conduce a la osteoartritis irreversible pérdida de cartílago y se acompaña de dolor crónico y 1,2 inmovilidad. Ingeniería tisular del cartílago ofrece un potencial prometedor para regenerar y restaurar la función del tejido. Esta tecnología implica normalmente la siembra de los condrocitos en andamios natural o sintético y el cultivo de las 3D da como resultado la construcción en un medio equilibrado en un período de tiempo con el objetivo de la ingeniería bioquímica y un tejido maduro biomecánica que pueden ser trasplantados en un sitio de defecto en vivo 3-6 . Lograr una condición óptima para el crecimiento de los condrocitos y la deposición de la matriz es esencial para el éxito de la ingeniería de tejido cartilaginoso.
En la cavidad de la articulación del cartílago nativo, en el árticocular la superficie del hueso está bañado en el líquido sinovial. Este líquido claro y viscoso, proporciona nutrientes al cartílago articular avascular y contiene factores de crecimiento, citoquinas y enzimas que son importantes para el metabolismo de los condrocitos 7,8. Además, el líquido sinovial facilita el movimiento de baja fricción entre las superficies cartilaginosas, principalmente a través de secretar dos componentes clave, ácido hialurónico y lubricina 9 10. En contraste, el cartílago de la ingeniería tisular es más a menudo cultivadas en medios artificiales. Si bien estos medios de comunicación es probable ofrecer condiciones más definido para el estudio del metabolismo de condrocitos, el líquido sinovial refleja con más precisión el entorno natural de que los condrocitos articulares residen pulg
De hecho, el líquido sinovial tiene la ventaja de ser fáciles de obtener y almacenar, ya menudo puede ser renueva constantemente por el cuerpo. Varios grupos han complementado el medio de cultivo de líquido sinovial en el crecimiento humano, conejo, bovino, y el perro chondrocytes, pero la mayoría utilizan bajos niveles de líquido sinovial (por debajo del 20%) 11-25. Mientras que los condrocitos de pollo, caballo y humanos han sido cultivadas en el medio con mayor porcentaje de líquido sinovial, estos sistemas de cultivo de dos dimensiones 26-28. A continuación les presentamos nuestro método de cultivo de condrocitos articulares humanos en un sistema 3D con un alto porcentaje de líquido sinovial (hasta el 100%) durante un período de 21 días. Al hacerlo, hemos superado un gran obstáculo presentado por la alta viscosidad del líquido sinovial. Este sistema ofrece la posibilidad de estudiar los condrocitos humanos en el líquido sinovial en un entorno 3D, que puede combinarse con otros dos factores importantes (la tensión de oxígeno y la carga mecánica) 29,30 que constituyen el entorno natural de cartílago para imitar el medio natural para cartílago de crecimiento. Además, este sistema también puede ser utilizado para el ensayo de la actividad de líquido sinovial en los condrocitos y proporcionar una plataforma para el desarrollo deregeneración del cartílago tecnologías y opciones terapéuticas para la artritis.
Protocolo
Un sistema 3D para el cultivo de condrocitos articulares humanos en el líquido sinovial
En este trabajo, se encapsulan los condrocitos humanos articular en perlas de alginato usando una versión modificada de fabricación-sugirió la encapsulación de protocolo (Lonza, y 31). El uso de estas construcciones en 3D, hemos desarrollado un sistema para el cultivo de células en un medio de cultivo que contienen porcentajes variaron de líquido sinovial humano y han evaluado estas construcciones 3D para la expresión de genes del cartílago.
1. Prepare los condrocitos humanos articular (HAC) de tres dimensiones (3D....
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Discusión
En este informe, hemos desarrollado un método que permite el cultivo de condrocitos articulares humanos en un entorno 3D en un medio que contiene altas concentraciones de líquido sinovial humano. El líquido sinovial es uno de los principales componentes que constituyen el entorno natural en la cavidad de la articulación, donde residen los condrocitos articulares. Sin embargo, la viscosidad del líquido sinovial ha sido un gran desafío para tres dimensiones a largo plazo el cultivo de condrocitos. Para superar el reto de .......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Robin Nye (Tufts Medical Center), Uchimura Tomoya y Dana Cairns (Tufts University) para proporcionar ayuda para el almacenamiento del líquido sinovial y la centrifugación. Este trabajo fue financiado por el NIH (1R01AR059106-01A1) de LZ
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Materiales
Tabla de reactivos y equipos específicos:
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alginato (sal sódica del ácido algínico) | Sigma | A2158-250G | 2.4% de solución de almacenado a 40 ° C |
| Cloruro de calcio dihidrato, Granular | JT Baker | A19339 | |
| Los medios de comunicación condrogénica crecimiento | Lonza | CC-3156 (base de los medios de comunicación) | |
| CC-4409 (con suplemento) | |||
| Los medios de comunicación condrogénica diferenciación | Lonza | CC-3226 (base de los medios de comunicación) | |
| CC-4408 (con suplemento) | |||
| Condrocitos articulares humanos | Lonza | CC-2550 | |
| DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole diclorhidrato) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy mini kit (para la extracción de ARN) | Qiagen | 74104 | |
| PCR reactivos: SYBR-verde | Quanta | 95053-500 | |
| 12 ml jeringa | Tyco-Kendall-Monoject | 512852 | |
| 22 Gague aguja hipodérmica | Tyco-Kendall-Monoject | 8881 | |
| Microscopio | Olimpo | IX71 | |
| Plataforma oscilante | Thermolyne Thermoscientific | Vari-mix | |
| Cebadores secuencias | |||
| Colágeno IIa-forward | 5'-TTC ATC CCA CCC TCT AGT CAC-3 ' | ||
| Colágeno II a invertir | 5'-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3 ' | ||
| MMP13-forward | 5'-GCC TGT CTT CTT CAC ACA ACT GAC-3 ' | ||
| MMP13-reverse | 5'-GAG AGC AGA CTT TGA GTC TCA GCC-3 ' | ||
| Caspasa-3 hacia adelante | 5'-TTC TTA TCA AGG CCT GCC GTG GTA-3 ' | ||
| Caspasa-3 inversa | 5'-TGG ATG AAC CAG CCA GAG TCC TTT -3 ' |
Referencias
- Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
- Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E.
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Reimpresiones y permisos
