La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, Se extiende su probóscide para la alimentación, en respuesta a un estímulo de azúcar de su probóscide o tarso. Me han combinado observaciones de la respuesta de extensión probóscide (PER) con una técnica de imágenes de calcio, lo que nos permite monitorizar la actividad de las neuronas en el cerebro, a la vez con la observación del comportamiento.
Artículo de método
La grabación simultánea de señales de calcio en neuronas identificadas y comportamiento de alimentación de Drosophila melanogaster
En este artículo
Resumen
Resumen
Para el estudio de redes neuronales en términos de su función en el comportamiento, debemos analizar cómo las neuronas funcionan cuando cada patrón de comportamiento se genera. Por lo tanto, las grabaciones simultáneas de la actividad neuronal y el comportamiento son esenciales para la actividad del cerebro se correlaciona con el comportamiento. Para este tipo de análisis de comportamiento, la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, nos permite incorporar genéticamente codificados indicadores de calcio, tales como GCaMP 1, para controlar la actividad neuronal, y utilizar sofisticadas técnicas de manipulación genética para la optogenética o termogenico que activen específicamente identificado las neuronas 2-5. El uso de una técnica termogenico, nos ha llevado a encontrar las neuronas esenciales para el comportamiento de alimentación (Flood et al., En revisión). Como parte principal de la conducta alimentaria, un adulto de Drosophila se extiende su probóscide para la alimentación de 6 (respuesta de trompa de extensión; PER), en respuesta a un estímulo dulce de las células sensoriales en su probóscide o tarso. Combining el protocolo para PER 7, con una técnica de imágenes de calcio 8 utilizando GCaMP3.0 1, 9, he establecido un sistema experimental, donde se puede monitorear la actividad de las neuronas en el centro de alimentación - el ganglio suboesophageal (SOG), simultáneamente con la observación del comportamiento de la probóscide. He diseñado un aparato ("mosca del cerebro en vivo de imágenes y electrofisiología Etapa": "Las moscas") para dar cabida a un adulto de Drosophila, lo que permite su probóscide para moverse libremente, mientras que su cerebro está expuesto al baño de Ca 2 + de imágenes a través de una lente de inmersión en el agua . Las moscas es también apropiado para muchos tipos de experimentos en directo en el cerebro de la mosca como el registro electrofisiológico o una imagen de lapso de tiempo de la morfología sináptica. Debido a que los resultados de las imágenes en directo puede estar directamente relacionado con el comportamiento POR simultánea, esta metodología puede proporcionar un excelente sistema experimental para estudiar el procesamiento de información de las redes neuronales, y cómo este cactividad ellular está acoplado a los procesos de plástico y la memoria.
Protocolo
1. La construcción de las MOSCAS
- Forma una plataforma de la tapa de 35 mm de plato Falcon por fusión de la pared lateral y el tallado de ella para formar un ángulo apropiado y el espesor (Figura 1a; Figura 2). Haga un agujero en la plataforma para aceptar la cabeza mosca (Figura 1a, b), de tal manera que las partes de la boca son libremente expuesto al exterior de la cámara (Figura 1a). Cortar el extremo de una punta Pipetman, con el juego del tamaño de la mosca para ser observados. Pegar la punta a la plataforma, como se muestra en la Figura 1a para completar las moscas (Figura 2).
2. Preparación de la mosca para la observación
- Starve una mosca adulta durante 24 horas a 25 ° C antes del experimento, colocándolo en un vial con sólo una toalla de papel húmeda, si es necesario inanición.
- Anestesie la mosca colocándolo en un tubo de 15 ml de plástico de pie sobre el hielo.
- Con unas pinzas, inserte una mosca en la cámara de laVUELA, y empuje suavemente la marcha hasta que se es incapaz de moverse. Luego, inserte un tapón para retener la marcha. (Figura 1a, b).
- Selle las partes circundantes de la trompa proximal (tribuna) hasta el borde interior del agujero; Aplique una pequeña cantidad de adhesivo fotopolimerizable (Tetric EvoFlow) a los lados y por encima de la tribuna desde el exterior (flechas en la Figura 3). También aplicar el pegamento desde el interior de las moscas al espacio entre la parte dorsal de la cabeza y el borde interior del orificio (Figura 1b). Para permitir que la tribuna se mueva libremente, se debe tener cuidado para evitar cualquier pegamento de contacto con la tribuna con una pestaña (o algo similar) para extender el pegamento. Por último, para curar el pegamento con el más débil de la iluminación de la luz azul suficiente para curar para evitar daños a la marcha de un calor excesivo. Retire el tapón.
- Un hilo para mantener la tribuna parcialmente levantado (flecha en la Figura 3) se pueden emplear para estabilizar el vuelo "s la cabeza, evitando golpes de la parte faríngea de SOG y para exponer la parte ventral de la SOG, especialmente para las terminales presinápticas de imágenes de las neuronas Gr5a 8, que están cubiertos por parte de la faringe cuando la trompa está completamente retraída.
- Completa la superficie de la plataforma con una solución salina que contiene azúcar (en mM): NaCl, 140; KCl, 2; MgCl 2, 4,5; CaCl 2, 1,5; y HEPES-NaOH, 5 con un pH de 7,1 10. Esta solución salina libre de sacarosa tiene tonicidad similares a los de uso común de sacarosa que contienen soluciones salinas tales como HL3.1 11.
- Abra la cápsula de la cabeza con una cuchilla de tungsteno y las pinzas con puntas afiladas como tijeras, que es un dispositivo fabricado a medida y diseñado originalmente por el Dr. Kageyuki Yamaoka, Japón, para recortar la cutícula y la tráquea para exponer el SOG (Figura 4). El borde ventral de la cutícula cabeza fue cortada como ventral como sea posible mientras que el corte borde dorsal no fue tan crítico. En primer lugar, hacer una incisión a través de laborde posterior utilizando una cuchilla de tungsteno. A continuación, cortar a través del lado y los bordes anteriores utilizando las pinzas afiladas. La pieza de la cutícula corte debe ser levantado con las pinzas y se retira. Los nervios de las antenas y las antenas deben ser cortadas por las pinzas afiladas.
- A fin de evitar artefactos de movimiento durante las grabaciones, el cerebro debe ser estabilizado mediante la eliminación de ciertas partes de la marcha. En primer lugar, eliminar selectivamente los sacos de aire entre la SOG y la cutícula. Cortar el esófago en el extremo hacia la faringe y al final de entrar en el SOG para eliminar la conexión entre la faringe y el cerebro. Luego tire del músculo 16 12, y finalmente, separar cualquier tráquea que conecta el cerebro y la cutícula.
- Nos pusimos nuestras moscas en el escenario de un microscopio Olympus BX51WI conectado a un sistema de microscopía confocal de disco giratorio (Improvisación en PerkinElmer) (Figura 5). Una lente de inmersión en agua, por ejemplo 40X/0.8 NA, se sumergió en el baño (Figura 6 ).
3. Ca 2 + de imágenes del cerebro
- Ca 2 + imágenes usando GCaMP3.0 1, 9 se realizó mediante el método establecido por Marella y col. 8 (Figura 6). Utilizando un microscopio confocal de disco giratorio (Improvisación), tomar una sola sección óptica a 4 Hz con un tiempo de exposición de 122ms con 491nm láser de excitación, centrándose en la región de interés (un cuerpo celular de una neurona motora, o una interneurona, o terminales presinápticos gustativos de las neuronas sensoriales) con el software de la velocidad, ver. 4,3 (Improvisación).
4. Estimular la probóscide
- Aspirar solución 100 mM de sacarosa acuosa en una aguja hipodérmica con una mecha pequeña (hecha de papel japonés Washi, véase la Tabla de los reactivos específicos) que sobresale de la punta (Figura 7).
- Descarga una pequeña gota de solución de sacarosa en la mecha, a continuación, se aspire, inmediatamente before la aplicación de la mecha empapada en papel washi a la punta de la trompa. La mecha de papel Washi sólo debe ser aplicado por un instante para evitar la saciedad (Figura 8). Monitorizar la respuesta de Extensión probóscide (PER) el comportamiento mediante una cámara CCD conectada a un microscopio de disección (Figura 5) simultáneamente con Ca 2 + de imágenes. Los datos deben tomarse dentro de una hora después de comenzar la disección porque la respuesta PER no se mantiene más de una hora bajo estas condiciones.
5. Los resultados representativos
Las neuronas motoras del transportador de tribuna, un par de músculos principales responsables de levantar la tribuna para la extensión de trompa, se ha informado que muestran respuestas sólidas a los estímulos dulces 13. Figura 9 muestra las señales de Ca 2 + a través GCaMP3.0 1, 9 expresada por un Ga 4, conductor, E49 13, a partir de un cuerpo celular de la neurona motora. Como se muestra en el video, un Robuc PER se observó en sincronía con un incremento en el Ca 2 + señal.
Figura 1. Esquema de la mosca de imagen cerebral en vivo y la etapa de Electrofisiología (moscas). una, las moscas se construye de tal manera que el ángulo de la pared permite la cabeza mosca a salir recta. Tres segmentos de la trompa de moscas están codificados por colores, la tribuna es de color magenta. La mosca se inserta en la cámara con fórceps, y una pieza cortada desde el extremo de una punta Pipetman está enchufado en la parte posterior de la cámara para bloquear la mosca de escape. B, el agujero se agujerea para ajustarse a la cabeza de la mosca. Los huecos restantes están sellados con pegamento fotopolimerizable como se indica para asegurar que no hay fugas. Después de que el pegamento se haya curado, la punta Pipetman como un tapón se retira. La solución salina se vertió en las moscas tales que la superficie del cerebro está completamente cubierto. Es necesario garantizar que no hay fugas salinaIng a cabo en el extremo anterior de la cabeza mosca. El área sombreada rodeada por la línea discontinua en el panel B muestra la parte que se diseccionaron.
Figura 2. Fotografía de las moscas. La pared forma de media luna de pegamento (de una pistola de pegamento) se hace para controlar el flujo de solución salina durante la perfusión, y para reducir la cantidad de solución utilizada.
Figura 3. Vista frontal de una mosca montada en las moscas. Esta imagen muestra cómo una mosca se encuentra en las moscas, y cómo la cola de luz de curado se aplica alrededor de la cabeza de la mosca (flechas) para crear un sello a prueba de solución salina. Si las fugas de solución salina a través de la probóscide de la mosca, entonces el experimento fracasará. El hilo (puntas de flecha) atado a la etapa es llevar a cabo la trompa en su posición, de modo que no es completamente retracción Ted. De lo contrario, obstruyen la porción más ventral de la SOG y hacer que los artefactos de movimiento.
Figura 4. Top-visión de las moscas con una mosca disecada. Esta imagen muestra la exposición SOG de que se elimine la mosca cutícula siguiente. El esófago, músculo y 16 tráqueas conectado al cerebro, así como seleccionados sacos de aire también se han eliminado para evitar perturbar el cerebro, que puede conducir a artefactos en las señales de calcio.
Figura 5. El aparato de monitorización. Este aparato está montado a partir de un microscopio Olympus BX51WI conectada a un sistema microscopio confocal de disco giratorio (Improvisación), y un montaje lateral Nikon SMZ800 microscopio. Esta configuración permite la formación de imágenes en vivo de la actividad cerebral durante POR comportamiento.
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Figura 6. Las fotografías que muestran la vista lateral de las moscas. La fina capa de solución salina se intercala entre el 40X de inmersión en agua del objetivo y la mosca.
Figura 7. Esquema para hacer la mecha de papel Washi. Gampi-Washi es un pergamino de papel tradicional japonés que es extremadamente fina y suave (Haibara, Japón). También es muy fuerte y puede retener una gran cantidad de líquido. El papel Washi debe ser cortado en un trapecio con dimensiones muy específicas; 0,3 mm y 0,7 mm de ancho, y 4-5 mm de longitud (uno). Este trapezoide se inserta entonces desde el lado de 0,7 mm en la punta de una aguja hipodérmica 23 G y también se pueden estabilizar mediante la inserción de un pasador de insecto, que se dobla para una forma de V (b). C, el papel Washi se convierte después de la exposición transparentea un líquido, lo que es ideal para este experimento.
Figura 8. La estimulación de la trompa de las moscas con el Washi-mecha. La mecha de papel Washi en la punta de una aguja hipodérmica se aplica por un instante utilizando un manipulador joystick con una mano. La aguja se conecta a través de un tubo flexible a un inyector manipulado con la otra mano, para aspirar y descargar solución de sacarosa.
Figura 9. Los resultados representativos. A, por el comportamiento registrado por la cámara CCD instalado en el microscopio estereoscópico. Vistas frontales de una mosca muerta de hambre con una probóscide largos (flechas) antes de la estimulación, en la estimulación, y después de la estimulación con una mecha que contenía 100 mM de sacarosa solución acuosa (cabeza de flecha). La iluminación se logra mediante un láser nm 491 utilizadode GCaMP fluorescencia. b, sacarosa-inducida GCaMP 3,0 de respuesta en la neurona del motor para el transportador de la tribuna del músculo en el estado de hambre. El panel superior, antes de la estimulación, el panel inferior, inmediatamente después de la estimulación. Barra de escala, a 10 m. C, la cuantificación de la respuesta inducida por sacarosa GCaMP 3.0. La neurona motora responde a un estímulo de sacarosa por un fuerte aumento de la fluorescencia seguida por una fase de restauración de varios segundos a la línea base.
Discusión
Los MOSCAS permite la grabación simultánea de señales de Ca 2 + y el comportamiento de PER. Incluso con el cerebro expuesto a la solución salina normal, POR comportamiento se observó. Usando la mecha Gampi-Washi en lugar de una mecha Kimwipe utilizado en la method7 capilar original facilita un comportamiento POR altamente reproducible y estable y evita la necesidad de ser experto en la fabricación y la elección de una mecha Kimwipe buena. Los consejos de experimentación se ha dicho nos ha permitido evitar con éxito las perturbaciones por el movimiento de la trompa, lo que lleva a una grabación muy estable de Ca 2 + señales con poco ruido. En ocasiones, la extirpación de tejido no era suficiente para exponer a las células o suprimir el movimiento de manera adecuada, dando lugar a malos resultados. Sin embargo, una vez que eran expertos, más del 80% de las preparaciones producido buenos resultados. Esta metodología es no sólo para el Ca 2 + de imágenes, pero también se puede adaptar a cualquier imágenes en vivo mientras se observa POR comportamiento. Por ejemplo, podemos acceder a cualquier celular a través de lael uso de un electrodo para grabar directamente la actividad. Combinado con el microscopio de excitación de dos fotones, que son capaces de realizar imágenes de lapso de tiempo de la estructura sináptica, lo que puede estar relacionado con cambios de comportamiento. Por lo tanto, este método de imágenes cerebrales con la observación del comportamiento no sólo es valiosa para la disección funcional de la red neuronal, pero podría ser utilizado como una herramienta potente para correlacionar 14 plasticidad sináptica a los mecanismos que subyacen a la memoria.
Divulgaciones
No tengo nada que revelar.
Agradecimientos
Doy las gracias a L Watanabe, Gorczyca M y otros miembros del laboratorio de Yoshihara por sus valiosos comentarios y discusión. Doy las gracias a K. Scott y Looger L. para las poblaciones de mosca, S Yokoyama para la demostración de experimentos, Shinya Iguchi para la ayuda técnica y Nobuko Yoshihara de información relevante. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Mental de subvenciones MH85958, y la Fundación Worcester de MI
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del Equipo / Reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Tetric EvoFlow | Ivoclar Vivadent | M04115 | Fotopolimerizable pegamento |
| BX51WI Microscopio | Olimpo | BX51WI | Con 40x (NA 0,8) la lente objetivo de inmersión en el agua |
| Spinning sistema de disco microscopio confocal | Improvisación de PerkinElmer | Con láser de 491 nm | |
| Estereomicroscopio | Nikon | SMZ-800 | Se adjunta a un brazo oscilante. Visión estéreo está disponible con grabación de vídeo |
| Gampi-papel washi | Haibara, Japón | Un tipo especial de papel tradicional japonés | |
| CCD de la cámara | Imaging Source | DFK41AU02 | 1/2 "1080 × 960 píxeles SONY CCD |
| Joystick manipulador | Narishige | MN-151 | |
| Inyector | Narishige | IM-5B |
Referencias
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